-
各种微生物生化试验方法原理
通常利用生化试验的方法，
检测细菌对各种物质的代谢作用及其代谢产物，
称为细菌的生化
反应，常用于细菌的鉴别。
1
、
糖类分解产物
（
1
）
糖发酵试验
（
carbohydrate fermentation test
）
不同种类的细菌对糖的分解利用能力不同，
一般以能否分解某种糖，是否
产酸产气等现象来鉴别。例如大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖，
产酸且产气；
而伤寒杆菌只分解葡萄糖产酸不产气，
且不分解乳糖。
这是因为大肠杆菌分解
葡萄糖等产生甲酸，经甲酸解氢酶的作用生成
< br>H2
和
CO2
。而伤寒杆菌无此
酶，故分解葡萄
糖只产酸不产气。
（
2
）
VP
试验
（
V
oges-Proskauer
test
）产气杆菌将分解葡萄糖产生的两分子丙酮酸脱羧，生
成一分子乙酰甲基甲醇。
乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中氧气氧化，
生成二乙酰，
二乙
酰可与培养液中含胍基的化合物（如
蛋白胨中的精氨酸）反应，生成红色的化合物，此为
VP
试验阳
性。大肠杆菌分解葡萄糖不生成乙酰甲基甲醇，故
VP
试验阴性
。
（
3
）<
/p>
甲基红试验
（
methyl red t
est
）
大肠杆菌和产气杆菌均属
G-
短杆菌，
且都能分解葡萄糖、
乳糖产酸
产气，二者不易区别。但两者所产生的酸类和总酸量不一：大肠杆菌可产生甲酸、
乙酸、
乳酸、琥珀酸等，而产气杆菌只产生甲酸、乙醇及乙酰甲基甲醇。故大肠杆菌培养液
PH
在
4.5
以下，加入甲基红指示剂呈红
色，为甲基红试验阳性；产气杆菌培养液
PH
在
5.4
以上，加入甲基红后呈桔黄色，为甲基红试验阴性。
（
4
）枸橼酸盐利用试验
(citrate utilization
test
）
产气杆菌在以枸橼酸盐为
唯一碳源的培养基
上生长，分解枸橼酸盐产生
CO2
，并转变为碳酸盐，使培养基由中性变为碱性，含溴麝香
草酚蓝（
BTB
）指示剂的培养基由淡绿色变为深兰色，此为枸橼酸盐利用试验阳
性。大肠杆
菌不能利用枸橼酸盐，故在此培养基上不能生长，培养基仍为绿色。
2
、蛋白质及氨基酸的分解产物
（
1
）硫化氢试验（
hydrogen sulfide test
）
有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸（如胱氨
酸、甲硫氨酸等）产生<
/p>
H2S
，如遇醋酸铅或硫酸亚铁，能生成黑色的硫化物，为硫化氢
试验
阳性。本试验常用于区别肠道杆菌的种类。沙门氏菌属通常为阳性
< br>;
大肠杆菌、产气杆菌、
志贺氏菌为阴性。
（
2
）明胶液化试验（<
/p>
gelatin liguefaction
test
）
有些细菌具有明胶酶，能
分解明胶使其失去
凝固能力而液化。变形杆菌、霍乱弧菌、绿脓杆菌、枯草杆菌等能液化
明胶；大肠杆菌、沙
门氏菌则不能。
（
3
）吲哚试验（
indole
test
）
有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成无色
吲哚，加入对
-
二甲基氨基苯甲醛，无色吲哚生成红色玫瑰吲哚，
为吲哚试验阳性。大肠杆菌、霍乱弧菌等吲哚试验阳性；
产气杆
菌、伤寒沙门氏菌为吲哚试
验阴性。
吲哚
对二甲基氨基苯甲醛
玫瑰吲哚
细菌的生化反应是鉴别细菌
的重要手段：其中吲哚试验
（
I
）
、甲基红试验
（
M
）
、
VP
试验
(V)
和枸橼酸盐利用试验（
C
）
，简称为
IMVIC
试验，常用于大肠杆菌
与产气杆菌的鉴别。典型
的大肠杆菌的
IMViC
试验结果为“
++--
”
，
而产气杆菌是“
--++
”
。
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实验四、微生物的快速鉴定和自动化分析技术
如何使微生物学技术方法快速、准确、简易和自动化，一直是
微生物学工作者研究的热点，
尤其是临床医学方面，对微生物的快速准确鉴定，更是
时间就是生命
。近
20
多年来，随
着微电子、
计算机、
分子生物学、
物理、
化学等先进技术向微生物学的渗透和多学科的交叉，
这方面已取得了突破性进展，许
多快速、准确、敏感、简易、自动化的方法技术，不仅在微
生物鉴定中广为使用，而且在
微生物学的其它方面也被采用，推动了微生物学的迅速发展。
一、微量多项试验鉴定系统
该系统的
根本原理是根据微生物生理生化特征鉴定的结果，
而进行的数码分类鉴定。
这种技
术也称为简易诊检技术，
或数码分类鉴定法。
它是针对微生物的生理生化特征，
配制各种培
< br>养基、
反应底物、
试剂等，
分别
微量
（约
0.1ml
）
加入各个分隔室中
（或用小圆纸片吸收）
，
冷冻干燥脱水或不干燥脱水，
各分隔室在同一塑料条或板上构成检测卡。<
/p>
试验时加入待检测
的某一种菌液，培养
2
~48
小时，观察鉴定卡上各项反应，按判定表判定试验结果，用此
结果编码，查检索表
(
根据数码分类鉴定的原理编制成
)
，得到鉴定结果，
或将编码输入计算
机，用根据数码分类鉴定原理编制的软件鉴定，打印出结果。
微量多项试验鉴定系统已广泛用于动、植物检疫、临床检验、食品卫生、药品检查、环境监<
/p>
测、发酵控制、生态研究等方面，尤其是临床检验中深受欢迎，迅猛发展。国际上此技术的
产品，
或称系统，
种类繁多，
国内有河南开封医学生物研究所的肠杆菌科细菌鉴定卡
E-15
；
上海市卫生防疫站的发酵性革兰氏阴性杆菌鉴定系统
< br>SWF-A
；中国人民解放军一八一医院
的厌氧菌快速生
化鉴定系列
ARB-ID
；
深圳华士达
生物科技有限公司的肠杆菌科的细菌生化
鉴定卡
ENT
等。国外的产品已标准化、系统化和商品化，主要有法国生物
-
梅里埃集团的
API/ATB
；瑞士罗氏公司的
Micro-ID
，
Enterotu
be,Minitek
；美国的
Biolog
< br>全自动和手
动细菌鉴定系统：日本的微孔滤膜块等，其中
API/ATB
包括众多的鉴定系统，共计有
750
种反应，可鉴定几乎所有常见的细菌。微量多项鉴测技术优点突出，不仅能快速、敏感、准
确、重复性好地鉴检微生物，而且简易，节省人力、物力、时间和空间，缺点是各系统差异
较大，
有的价格贵，
有的个别反应不准，
难判定，
但毫无疑问，
它是微生物技术方法
向快速、
简易和自动化发展的重要方向之一。
API20E
系统是
API/ATB
< br>中最早和最重要的产品，也是国际上应用最多的系统。该系统的
鉴定卡是一块有<
/p>
20
个分隔室的塑料条，
分隔室由相连通
的小管和小环组成，各小管中含不
同的脱水培养基、试剂，
或底
物等，
每一分隔室可进行一种生化反应，
个别的分隔室可进行<
/p>
两种反应，主要用来鉴定肠杆菌科细菌，如图
1
< br>所示。
图
1 API
20E
鉴定卡示意图
鉴定未知细菌的主要过程：将菌液加入每一个分隔室；培养后，有的分隔室的小杯中需要
添加试剂，观察鉴定卡上
20
个分隔室中的反应变色
情况，根据反应判定表（表
1
），判定
各项反应是阳性还是阴性反应；
按鉴定卡上反应项目从左到右的顺序，
< br>每三个反应项目编为
一组，共编为七组，每组中每个反应项目定为一个数值，依次
是
1
、
2
、<
/p>
4
，各组中试验结
果判定的反应是阳性者
记
＋
，则写下
其所定的数值，反应阴性者记
－
，则写为
0
，每组
中
的数值相加，
便是该组的编码数，
这样便形成了
7
位数字的编码，
表
2
为举例说明；
用
7
位
数字的编码查
API20E
系统的检索表，或输入计算机检索，
则能将检验的细菌鉴定出是
什么菌种或生物型。
表
1
API20E
反应判定表
鉴定卡上的反应项目
反
应
结
果
代
号
项
目
名
称
阴
性
阳
性
β
-
半乳糖苷酶
无色
ONPN
黄
ADH
精氨酸水解
黄绿
红，橘红
LDC
赖氨酸脱羧
黄绿
红，橘红
ODC
鸟氨酸脱羧
黄绿
红，橘红
CIT
枸椽酸盐利用
黄绿
绿蓝
H
S
URE
黑色沉
淀
红紫
红紫
红
红
产
H2S
无色
尿素酶
黄
TDA
色胺酸脱氨酶
黄
IND
VP
GEL
吲哚形成
黄绿
V.P.
试验
无色
蛋白酶
黑粒
黑液
黄绿
黄绿
GLU
葡萄糖产酸
蓝
MAN
甘露醇产酸
蓝
INO
肌醇产酸
蓝
黄绿
黄绿
黄绿
黄绿
黄绿
黄绿
黄绿
SOR
山梨醇产酸
蓝
RHA
鼠李糖产酸
蓝
SAC
蔗糖产酸
蓝
MEL
密二糖产酸
蓝
AMY
淀粉产酸
蓝
ARA
阿拉伯糖产酸
蓝
表
2
API20E
举例说明
项目名
ONPG
A
DH
L
DC
O
DC
C
IT
H
2S
U
RE
T
DA
I
ND
V
P
G
EL
G
LU
M
AN
I
NO
S
OR
AR
RHA
S
AC
M
EL
A
MY
称
A
所定数
值
试验结
果
记下数
值
编
码
检索结
果
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
+
-
+
+
+
-
-
-
-
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1
0
4
1
2
0
0
0
0
1
0
4
1
2
4
1
2
4
1
2
5
3
0
5
7
7
3
5305773
产气肠杆菌（
Enterobacter
aerogenes
）
实验五、抗微生物药物敏感性试验
一、实验目的
抗微生物药物敏感性试
验
（药敏试验）
的主要目的检出细菌的耐药性，
预测抗微生物药物的
临床治疗效果，
并为临床医生针对
某一特定的临床感染选用药物提供依据。
对所有临床分离
的可疑
致病菌，
如不能从该菌的种属特征可靠地推知其对抗菌药物的敏感性，
< br>就需要进行药
敏试验。
纸片扩散法
二、实验原理
此法是临床和实验室标
准化研究所（
CLSI/NCCLS
）所推荐的临床微生物理学
室常规开展
的药敏试验方法。
将含有定量抗菌药物的纸片
（药敏纸片）
贴在已接种待检菌的琼脂平板表
面特定部位。
药物借其分子的扩散力向周围琼脂中扩散，
形成了
随着离纸片距离加大，
琼脂
中的药物浓度逐渐减少的梯度浓度。
其纸片周围一定区域琼脂内的药物浓度高于抑制待检菌
所需浓度
时，
则该区域内细胞不能生长，
形成透明抑制圈。
抑菌圈的大小可以反映待检对测
定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低
抑菌浓度（
MIC
）呈负相关，即抑菌圈愈大，
MIC
愈小。
三、实验器材和试剂
1
．菌种
金黄色葡萄球菌
ATCC25923
、大肠埃希菌
ATCC25922
、铜绿假单胞菌
ATCC278
53
或临床分离的菌株。
2
．培养基
MH
（
Mueller-
Hintion
）琼脂。
3
．试剂
无菌生理盐水，
0.5
麦氏标准比浊管（
McFarland
standard
< br>，相当于
1.5×
108CFU/ml
< br>），抗菌药物纸片：选用直径
6.35mm
吸水量
20μl
的专用药敏纸片，包括阿米卡星（
A
MK
）、青霉素（
PEN
）、氨苄西林
（
AMP
）、哌拉西
林（
PIP
）、头孢唑啉（
FZN
）、头孢呋辛（
FRX
）、头孢他啶（
CAZ
）、头孢他啶
/
棒酸
（
CD03
）、氨曲南（
ATM
）、亚胺培南（
IMP
）、环
丙沙星（
CIP
）、万古霉素（
VAN
）、
克林霉素（
CLI
）、复方新诺明（
SXT
）。
4
．其他
无菌棉拭子、镊子、毫米尺、接种环。
四、方法步骤
1
．菌液制备
（
1
）对数生长法：从琼脂平板上选取至少
< br>3-5
个形态特征一致的菌落，用接种环转移至含
4~5
ml
的肉汤培养管（如胰酶消化大豆肉汤）中，
35
℃孵育
2-6h
。用无菌盐水或肉汤调
整菌液浊度相当于
0.5
麦氏标准。
（
2
）
< br>直接菌落法：
从孵育
18-24h
的非选择性培养基
（如血琼脂）
平板上，
挑取单个菌落，
直接用肉汤或无菌盐水制成
0.5
麦氏标准浊度的悬液。
2
．接种
细菌悬液制备后
15min
内接种至
M
H
琼脂平板。用无菌棉拭醮取菌悬液，在管
内壁液面上方旋转紧
压，将多余菌液挤去，最后沿平板内缘涂抹一周。
3
．贴药敏纸片
涂布后的平板在室温下干燥
3-5m
in
，用纸片分配器或无菌镊子将纸片贴于琼脂表面并轻
压，使
纸片与琼脂表面完成接触。各纸片中心相距应大于
24mm
，纸
片贴上后就不能再移
动位置。
4
．孵育
将
平板倒置放入
35
℃孵箱（苛养菌敏平板应放置于
5%-10%CO2
环境中），
16-18h
读
取结果，葡萄球菌和肠球菌必须孵育
24h
以检测对苯唑西林和万古霉素的耐药性。
五、结果判断
抑菌圈的直径（包含纸
片的直径），以毫米数报告（取整数）。根据
CLSI
判定标准
测量抑
菌圈直径大小可以判断细菌对该抗生素是敏感、中介还是耐药。
< br>
敏感（
S
）：表示常规剂量的
测定药物在体内所达到的浓度能抑制或杀灭待测菌。
中介（<
/p>
I
）：不是敏感性的度量，而是一个
“<
/p>
缓冲区
”
，用以防止因微小的技术因素失
控导致
的结果偏差，因而其临床意义是不确定的，故不应作临床报告。
< br>
耐药（
R
）：表示常规剂量的
测定药物在体内达到有效浓度时不能抑制待测菌生长。
六、药敏试验结果判断注意事项
（<
/p>
1
）药敏试验的结果容易受培养基、抗菌药物、孵育条件等多种因
素影响，实验室开展药
敏试验时应定期用标准菌株对上述因素进行质量控制。
（
2
）变形杆菌属的菌
株可扩散到某些抗菌药物的抑菌圈内，所以在明显的抑菌圈内有薄膜
样爬行生长可以忽略
。
（
3
）对
于链球菌应检测生长抑制圈而不是溶血抑制圈。对于甲氧苄啶和磺胺，拮抗物可使
细菌轻
微生长，所以抑菌圈直径的检测不考虑细微生长的部分（生长菌苔的
20%
或以下）
而测量比较明显的边缘。
（
4
）对于沙门菌属和志贺菌属的分离株只有氨苄西林
、一种喹诺酮类药物和磺胺甲唑
/
甲
氧
苄啶可用于常规试验和报告，
第一、
第二代头孢菌素和氨基糖苷
类抗生素体外可能对这些
菌株有活性，但临床却无效，所以对上述药物不应报告为敏感。
（
5
）沙门
菌属的肠道外分离株应测试并报告氯霉素和一种三代头孢菌素的敏感性。
（
6
）肠球菌属对头孢菌素类、氨基糖苷类（仅筛选
高水平耐药性）、磺胺甲
唑
/
甲氧苄啶
和克林霉素在体外可能有活性，但在临床上耐药，所以不能
报告对这些药物敏感。
七、影响药敏结果的因素
1.
培养基：应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约
5-6mm
），不
可太薄，一般
90
mm
直径的培养皿，倾注培养基
18-20ml
为宜。培养基内应尽量避免有
抗菌药物的拮抗物质，
如
钙、
镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，
胸腺嘧啶核苷和对氨
苯
甲酸（
PABA
）能拮抗磺胺药和<
/p>
TMP
的活性。
2.
细菌接种量：
细菌接种量应恒定，
如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗
菌活性。
3.
药物浓度：
药物的浓度和总量
直接影响抑菌试验的结果，
需精确配制。
商品药应严格按照
其推荐治疗量配制。
4.
培养时间：一般培养温度和时间为
37
℃
8-18
小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可
将已放好抗菌药的平板培养基，
先置
4
℃冰箱内
2-4
小时，
使抗菌药预扩散，
然后再放
37
℃
温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。
八、思考题
1.
操作药敏试验并说出注意事项。
2.
试述药敏试验的意义？