-
桂林医学院毕业设计（论文）
正常小鼠和
IL
-
10
基因敲除小鼠肠道菌群多态性分析
院
系
:
生物技术学院
学
号
:
0931018
姓
名
:
程骏
专
业
:
2009
级生物技术
指导老师
:
朱嗣博
2013<
/p>
年
5
月
22
日星期三
1
正常小
鼠和
IL
-
10
基因敲除小鼠肠道菌群多态性分析
2009
级生物技术
程骏
指导老师
朱嗣博
摘要
【
目的
】
设计应用
T-RFLP
技术，
对正常小鼠和
IL-10
基因敲除小鼠的肠道菌
群进行多态性分析；
【
方法
】设计一个引物的
5
‘
末端用荧光物质标记（常用荧光
物质有
HEX,TET,6-F
AM
等）
，
使样本
DNA
经
PCR
后都带有这种荧光
物质；
【
结果
】
PCR
产物经纯化后酶切，
可以先进行琼脂糖凝胶电泳，
最后对酶切后的产物末端进行
测序得到了
T
-RFLP
峰谱图
,
该图谱能够快
速准确地对不同种的菌群进行定性、
定量的分析；
【
结论
】
成功使用
T-RF
LP
技术对正常小鼠和
IL10
基因敲
除小鼠的肠
道菌群进行多态性分析，
得到两种小鼠肠道菌群的差
异性，
经分析可以得到一种
或几种菌群对于
IL-10
有特殊的联系。对于
IL-10
的应用有重要作用。
关键词
T-RFLP
技术；基因图谱；
IL-10
基因
Il-10 GENE
knockout mice and normal mice intestinal flora
polymorphism analysis
2009-biotechnology
Cheng Jun
Supervisor
ZhuSibo
Abstract
【
Objective
】
Designing
application
of
T
-
RFLP
technique,
the
normal
mice
and
IL-10
knockout
mice
intestinal
flora
polymorphism
analysis.
【
Methods
】
Designing
a
primer
5
'terminal
marked
with
fluorescent
substances
(commonly
used
fluorescent
substance
has
a
HEX,
TET,
6
-
FAM,
etc.),
after
making
the
sample
DNA
by
PCR
with
the
fluorescent
substance.
【
Results
】
PCR product
after purification of the enzyme, can first
carries
on
the
agarose
gel
electrophoresis,
finally
after
enzyme
digestion
of
the
end
product
sequencing
got
T
-
RFLP
peak
spectra,
the
map
can
rapidly
and
accurately
for
different
kinds
of
microbes
for
qualitative
and
quantitative
analysis.
【
Conclusion
】
Successful
using
T
-
RFLP
technique
of
IL-10
knockout mice and
normal mice intestinal flora polymorphism
analysis, get the
differences
of
two
kinds
of
intestinal
flora
in
mice,
by
the
analysis
of
one
or
several kinds of bacteria can be have a
special connection for the IL - 10. For the
application of IL - 10 play an
important role.
Key words
T - RFLP technique; Gene mapping; Il-10
gene
首先介绍一下<
/p>
IL-10
，在
1989
年，
Mosmannand
及他们的同事描述了一种新
的免疫介质，
由
Th2
细胞克隆分泌，
能够抑制
Th1
细胞克隆
IL-2
和
IFNr
的合成。
早期被命名为细胞因子合成抑制因子（
CSIF
），这种因子后来被命名为
IL-10
，
在这被发现的
21
年期间
，很多研究深入剖析了这个细胞因子的生物学特性
.
2
IL-
10
的分子量为
35
～
40kd
，通常为二聚体；主要由
TH2
细胞产生，
也可由单核细胞、角质细胞及活化的
B<
/p>
细胞产生。
IL-10
能够抑制活化的<
/p>
T
细胞产生细胞因子，因此曾称为细胞因子合成抑制因子（
csif
），特别是
抑制
th1
细胞产生
il-2
、
ifn
γ
和
lt
等细胞因子，
从而抑制细胞免疫应答。
IL
-10
可降低单核－巨噬细胞表面
mhcⅡ类分子的表达水平，
损害了
apc
的
抗原递呈能力，实际上
这可能是其抑制细胞介导免疫的原因。此外，
IL-10
还能抑
制
NK
细胞活性，干扰
NK
细胞和巨噬细胞产生细胞因子；但可刺激
B
细胞分
化增殖，促进抗体生成。
近年来分子生物学技术已被广泛地应用于微生物群落结构分析
,
主要的研
究方法包括
:
聚合酶链式反应
(Polymerase chain rea
ction,PCR)
、荧光原位杂
交法
( Fluorescence in situhybridization, FISH)
、限制性酶切片段长度多态
性分析法
(Restric
tion fragment length polymorphism,RFLP)
、变性梯度凝胶
电泳法
(Denaturinggradient gel electrophoresis, DGGE)
和末端限制性片段
长度多态性分析
(Termi
nal
restrictionfragment
length
polymorphism,
T-RFLP)
等
[1]
。<
/p>
T-RFLP
的技术原理是根据的保守区设计通用引物，其中一个
引物的
5
‘末
端用荧光物质标记，
常用荧光物质有
HEX,TET,6-FAM
等。
提取待分析样的中
DNA
，
以他为模板进行
PCR
扩张，
所得到的
PCR
产物的一段就带有这种荧光标记，<
/p>
然后
PCR
产物有合适的限制性内切酶进
行消化，
一般选用酶切位点为
4bp
的
限制性内
切酶。
由于在不同细菌的扩增片段内存在核苷酸序列的
差异，
酶切位点就会存在
差异，
酶切后
就会产生很多不同长度的限制性片段。
消化产物用自动测序仪进行
测定，
只有末端带有荧光性标记的片段能被检测到。
因为不同
长度的末端限制性
片段必然代表不同的细菌，
通过检测这些末端
标记的片段就可以反应微生物群落
组成情况
[2]
。
这种方法还可以进行定量分析，
在基因扫描图谱上，
每个峰面积占总峰面积
的百分数
代表这个末端限制性片段的相对数量，
即末端限制性片段的数量越大其
< br>所对应的面积越大
[3]
。
一、
材料和实验流程
1
、实验材料、试剂和设备
1.1
实验材料：正常小鼠和
IL-10
基因敲除小鼠的粪便以及它们的肠道组织。样
本有两组
,
一组样本有十六个
,
另一组样本有八个。
1.2
实验试剂：
细菌基因组
DNA
提取试剂盒，
PCR
反应体系所需试剂
DNA
聚合酶、<
/p>
dNTP
、
buffer
、上下游引物（自己设计，标记荧光，交由生工合成），纯化
试剂盒，酶切反应
体系所需试剂酶、
buffer
，
DN
A
电泳液电泳所需试剂琼脂
糖凝胶、电泳液、
< br>marker
、
loading
等。
3
1.3
实验设备：
移液枪，
枪头，
PCR
仪，
金属浴仪，
D
NA
电泳仪，
灭菌锅，离心机，
振荡器
，
PH
计，净化工作台，
DNA
分析测序仪（交由生工分析）等。
2
、实验流程
2.1
细菌基因组
DNA
提取（小鼠粪便基因组提取试剂盒）
1
）将样品加到
2ml
的
EP
管中；
2
）加
400ulAP1
和
4ulRN
aseA
，
65
℃温浴
10min
，每三分钟颠倒混匀一次（温浴时
间可适当
延长）；
3
）加
130ulAP2
，混匀，冰浴
5min
< br>，
14000rpm
5min
；
4
）将上清转移到
2ml
吸附柱内，
1
4000rpm 5min
；
5
）
将收集管内上清移入一个新的
EP
管内，
不可有沉淀，
加入
1.5
倍的
AP3
，
混匀；
6
）分次将混合液
移入一个新的
2ml
吸附柱内，
800
0rpm
1min
，弃掉收集管中液
体；
7
）将吸附柱移入一个新的收集管内，加
5
00ulAW
，
8000rpm
1min
，弃掉收集管
中液体；
8
）再加
500ulAW
< br>，
14000rpm
2min
；
9
）
将吸附柱移入一个
2ml
的
EP
管内，
加
100
ul
超纯水
（
55
℃）
洗脱，
室温静置
5min
，
8000rpm 1min
，在通风处放
置
1min
，再重复一次效果更佳。
2.2
引物设计
上游引物
< br>8F(5
′
-AGAGTTTGATYMTGGCTCA
G-3
′
)
，在
5
′末端加上荧光物质
6-FAM
标
记，下游引物
806R(5
′
-GGA
CTACCRGGGTATCTAA-3
′
)
< br>，在
5
′末端用
HEX
进行标
记
[4][5][6]
< br>。
2.3
PCR
扩增反应
PCR
扩增反应体系采用
50
μ
L,
模板量为
2
μ
L,
阴性对照用
< br>ddH
2
O
代替模板
DNA
。
PCR
扩增条件为: 94 °C 5min;
94 °C 30 s, 52 °C 30 s,72 °C 2 min,
共
30
个循环;
72
°C
10
min。
PCR
反应完成后用
DNA
凝
胶回收试剂盒切胶回收
800bp
位置的
DNA
条带。
2.4
限制性内切酶酶切
选用
Hha
Ⅰ作为实验的限制性内切酶。酶切体
系采用
40
μ
L, PCR
产物为
6
μ
L,
在37 °C
酶切
6 h,
反应完成后
,
Hha
Ⅰ在65 °C 水浴中
20
min
失活。
2.5
琼脂糖凝胶电泳分析
在酶切完全之后，取
5ul
的酶切液进行电泳
，
140V
，
30min
，看电泳条带，一般
这个条带会很淡，因为主条带被切碎成很多的片段，大小
不一，分布的很开，因
此我们主要还是看
800bp
位置的条带是否还是存在，一般酶切完全之后这个位置
的条带基本就已经没
有了，
其实在酶切的过程中就会进行多次电泳来决定其酶切
的时
间和程度，以便于及时停止酶切反应，保证酶切的质量。
4
2.6
T-RFLP
分析的流程图
上面是两张简易的
T-RFLP
流程图，可
以比较直观方便了解其实验的步骤：
2.7 T-RFLP
图谱预处理
<
/p>
对于每个图谱，去除荧光强度小于
100
和片段大小≦
35
或者≥
500
的片段数
据，将剩下片段的峰面积进行标准化处理，并去除相对丰度小
于
1
％的片段
[7][8]
。
2.8
数据分析
将
T-RFLP
的数据转换成
1
～
0
矩阵（
1
表示有，
0
表示无），利用
SPSS16.0<
/p>
中的
聚类分析工具（
Classifiy
-hierarchical Analysis
），采用非加权配对算法平
均法对每组样本进行聚类分析。
接下来用软件<
/p>
SPSS16.0
进行物种丰度（
S
）和
Shannon-Weiner
指数（
H
）的计
算
,
结果用图表显示。
二、结果
用提取的八个粪便样本的基
因组做
PCR
，
电泳图如右：
八个样本的编号从左到右依次是：
P3
、
21B
、
23
、
59A
、
P1<
/p>
、
29
、
47A
、
P4
前四个样本是干预组的，后四个是对照组。
< br>每一组四个样本的小鼠都是经过相同处理的，
通过电
泳图
的观察来决定酶切时所加的
PCR
产物量的多少，
来保证酶切的
DNA
量接近，不会相差太多，导致误
差
太大。
Hha
Ⅰ酶切充分之后，
进行
DNA
分析
测序，
得到
T-RFLP
的图谱和原始
数据。
图谱分析：
5
遵循的原则：
Any fragment of
≦
35 or
≥
500bp was
excluded
；
T-RFs
can vary over a range of 1~3 bp among different
gels or lanes
[9][10]
.
左面是干预组的
两张图谱，样本
号分别是
23
和
P3.
《坐标表示
-
（
Size
，
Height
）》
同一组样本的图
谱在峰值区域的
存在基本上是一
致的，
500bp
以上
的峰值可能是没
有酶切开或者是
酶
切
不
了
的
片
段，不作为参考
依据。峰值的高
低差异在一
定范
围内都是属于正
常的。
左面是
对照组的
两张图谱，样本
编号分别是
P
1
和
59.
这两张图谱的峰
情况基本相同，
差异不大。
比较对照组和干预
组
的图谱
，
不难发
现
这两组之
间最大
的差异
大致
就在
size95bp~100bp
间的峰。接下来就进行具体的统计学分析，见表格一。
6
表格一：
从统计学分析中能看到差异较大的有两个区域，
size
大小分
别是
92bp~99bp
，
225bp
~369bp
。
三、
讨论
人
体肠道内有
10
14
的细菌，包括大量的专性厌氧菌。由于传统方法的局限，
有不少的菌是无法进行
培养的，因此一般分离培养方法只能分析出人肠道内
40%
左右的细菌，导致研究的片面性。而基于
16srRNA
的
T
－
RFLP<
/p>
不需要分离培养过
程，理论上可以检测到微生态系统中所有的菌<
/p>
[11]
。
I
L-10
基因的发现及
IL-10
细胞
因子在动物体中的重要作用越来越引起大家
的注意，特别是其在免疫系统中的作用。现在
有一些病人因为
IL-10
细胞因子的
原因患了一些疾病，
因此我们对
IL-10
进行了研究，
我们通过
T-RFLP
技术对
IL-10
细胞因子在肠道菌群中的影响进行研究
[12]
。
通过
T-RFLP
技术得到的数据，我们可以初步判定
IL-10
基因对于小鼠的肠
道菌群是有很大影响的
，
正常小鼠和
IL-10
基因敲除小鼠
之间肠道菌群存在很大
[13]
差异，至少有一种或多种菌群在
数量上差异很大
。
T-RFLP
技术能够对微生态系统进行准确快速的动态检测，拥有易于自动化
和
数据共享等优势
[14]
。
7
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