-
人中性粒细胞弹性蛋白酶（
NE
）酶联免疫分析
（
ELISA
）
试剂盒使用说明书
本试剂仅供研究使用
目的：本试剂盒用于测定人血清，血浆及相关
液体样本中中性粒细胞弹性蛋白酶（
NE
）的含量。<
/p>
实验原理：
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人中性粒细胞弹性蛋白
酶（
NE
）水平。用纯化的
人中性粒细
胞弹性蛋白酶（
NE
）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被
单抗的微孔中依
次加入中性粒细胞弹性蛋白酶（
NE
）
，再与
HRP
标记的中
性粒细胞弹性蛋白酶（
NE
）抗体
结合
，形成抗体
-
抗原
-
< br>酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物
TMB
显色。<
/p>
TMB
在
HRP
酶的催化下转化成蓝色，
并在酸的作用下转化成最终的黄色。
颜
色的深浅和样品中的中性粒
细胞弹性蛋白酶（
NE
）呈正相关。用酶标仪在
450nm
波长下测定吸光
度（
OD
值）
，通过标
准曲线计算样品中人中性粒细胞弹性蛋白酶（
NE
）浓
度。
试剂盒组成
：
试剂盒组成
说明书
封板膜
密封袋
酶标包被板
标准品：
45
μ
g/L
标准品稀释液
酶标试剂
样品稀释液
显色剂
A
液
显色剂
B
液
终止液
浓缩洗涤液
48
孔配置
1
份
2
片（
48
）
1
个
1
×
48
0
.5ml
×
1
瓶
1.5ml
×
1
< br>瓶
3
ml
×
1
瓶
3
ml
×
1
瓶
3
ml
×
1
瓶
3
ml
×
1
瓶
3ml
×
1
瓶
（
20ml
×
20
倍）×
1
瓶
96
孔配置
1
份
2
片（
96
）
1
个
1
×
96
0
.5ml
×
1
瓶
1.5ml
×
1
< br>瓶
6
ml
×
1
瓶
6
ml
×
1
瓶
6
ml
×
1
瓶
6
ml
×
1
瓶
6ml
×
1
瓶
（
20ml
×
30
倍）×
1
瓶
保存
2-8
℃保存
2-8
℃保存
2-8
℃保存
2-8
℃保存
2-8
℃保存
2-8
℃保存
2-8
℃保存
2-8
℃保存
2-8
℃保存
样本处理及要求
：
1.
血清：
室温血液自然凝固
10-20
分钟，
离心
20
分钟左右
（
2000-3000
转
/
分）
。仔
细收集上
清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.
血浆：应根据标本的要求选择
E
DTA
或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合
10-20
分钟后，离心
20
分钟左右（
2000-3000
转
/
分）
。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次
离心。
3.
尿液：用无菌管收集，离心
20
分钟左右（
2000-3000
转
/
分）
。仔细收集上清，保
存过程
中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4.
细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集
。离心
20
分钟左右（
2000-30
00
转
/
1
分）
。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用
PBS
（
PH7.2-7.4
）稀释细胞悬液，细胞
浓度达到
100
万
/ml
左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份
。离心
20
分
钟左右（
2000-3000
转
/
分）
。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5.
组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的
PBS
，
PH7.4
。用液氮迅速冷冻保存备
用。标本融化后仍然保持
2-8
℃的温度。加入一定量的
PBS
（
PH7.4
）
，用手工或匀浆器
< br>将标本匀浆充分。离心
20
分钟左右（
< br>2000-3000
转
/
分）<
/p>
。仔细收集上清。分装后一份待
检测，其余冷冻备用。
6.
标本采集后尽早进行提取，提取按相关文
献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上
进行试验，可将标本放于
< br>-20
℃保存，但应避免反复冻融
.
7.
不能检测含
NaN3
的样品，因
NaN3
抑制辣根过氧化物酶的（
HRP
）活性。
操作步骤
1.
标准品的稀释与加样：在酶标包
被板上设标准品孔
10
孔，在第一、第二孔中分别加标
准品
100
μ
l
，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液
50
μ
l
，混匀；然后从第一孔、第二
孔中
各取
100
μ
l
分别加到第三孔和第四孔，
再在第三、
第四孔分别加标准品稀
释液
50
μ
l
，
混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取
50
< br>μ
l
弃掉，再各取
50
μ
l
分别加到第五、第六孔
中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液
50ul
，混
匀；混匀后从第五、第六孔中各
取
50
μ
l
分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准
品稀释液
50
μ
l
，混
匀后从第七、第八孔中分别取
50
μ
l
加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准
品稀释液
50
μ
l
，混匀后从第九第十孔中各取
50
μ<
/p>
l
弃掉。
（稀释后各孔加样量都为
50
μ
l
，
浓度分别为
30
μ
g/
L
，
20
μ
g
/L
，
10
μ
g/L
，
5
μ
g/L
，
2.5
μ
< br>g/L
）
。
2.
加样：分别设空白孔（空白对照
孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）
、待测样
品孔。<
/p>
在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液
40
μ
l
，
然后再加待测样品
10
μ
l
（
样
品最终稀释度为
5
倍）
。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混
匀。
3.
温育：用封板膜封板后置
37
℃温育
3
0
分钟。
4.
配液：将
30
（
48T
的
20
倍）倍浓缩洗涤液用蒸馏水
30
（
48T
的
20
倍）倍稀释后备用。
5.
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置
3
0
秒后弃去，如此
重复
5
次，拍干。
6.
加酶：每孔加入酶标试剂
50
μ
l
，空白孔除外。
7.
温育：操作同
< br>3
。
8.
洗涤：操作同
< br>5
。
9.
显色：每孔先加入显色剂
A50
μ
l
，再加入
显色剂
B50
μ
l
，轻轻震荡混匀，
37
℃避光显色
15
分钟
.
10.
终止：每孔加终止液
50
μ
l
，终止反应（
此时蓝色立转黄色）
。
11.
测定：以空白空调零，
450nm
波长依序测量各孔的吸光度（
OD
值）
。
测定
应在加终止
液后
15
分钟以内进行。<
/p>
注意事项：
1
．
试剂盒
从冷藏环境中取出应在室温平衡
15-30
分钟后方可使用，酶
标包被板开封后如未
用完，板条应装入密封袋中保存。
2
．
浓洗涤
液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
3
．
各步加
样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间最好
控制在<
/p>
5
分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。
< br>
4
．
请每次测定的同时做标准曲线，最好做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本
OD<
/p>
值
大于标准品孔第一孔的
OD
值）
，请先用样品稀释液稀释一定倍数（
n
倍）后再测定，计
2
算时请最后乘以总稀释倍数（×
n
×
5
）
。
5
．
封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6
．
底物请避光保存。
7
．
严格按
照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准
.
8
．
所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9
．
本试剂不同批号组分不得混用。
10.
如与英文说明书有异，以英文说明书为准。
计算：
以标准物的浓度为横坐标，<
/p>
OD
值为纵坐标，
在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的
OD
值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释
倍数；或用标准物的浓度与
OD
值计算出标
准曲线的直线回归方程式，将样品的
OD
值
代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释
倍数，即为样品的实际浓度。
试剂盒性能：
1.
< br>样品线性回归与预期浓度相关系数
R
值为
0.990
以上。
2.
批内与批见应分别小于
9%
和
11%
检测范围：
2
μ
g/L
-40
μ
g/L
保存条件及有效期：
1.
试剂盒保存：
；
2-8
℃
。
2
．有效期：
6
个月
3
（此图仅供参考）
Human neutrophil
elastase(NE)
FOR RESEARCH USE
ONLY
Drug Names
Generic
Name
：
Human neutrophil
elastase(NE) ELISA Kit.
Purpose
This kit
allows for the determination of NE concentrations
in Human serum, blood plasma,
and other
biological fluids.
Principle
of the assay
T
he kit assay
Human NE level in the
sample
，
use Purified Human NE
antibody to coat
microtiter plate
wells, make solid-phase antibody, then add NE to
wells, Combined NE antibody
which With
HRP labeled, become antibody - antigen - enzyme-
antibody complex, after washing
Completely,
Add
TMB
substrate
solution,TMB
substrate
becomes
blue
color
At
HRP
enzyme-catalyzed, reaction is
terminated by the addition of a sulphuric acid
solution and the
color
change
is
measured
spectrophotometrically
at
a
wavelength
of
450
nm.
The
concentration of NE in the samples is
then determined by comparing the O.D. of the
samples to
the standard curve.
4
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