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膜蛋白的分离
2005-6-18
17:02:55
来源：丁香园
一、简介：
1
细胞质膜资料
< br>1895
年
,Overton
从
研究细胞透性得出
细胞膜由连续的脂类物质组成
。
1925
年
Gorter&Grendel:
用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积，提出
：
细胞膜是由双层脂分子组成
。
1935
年
Danielli&Davson
：从测定膜的表面张力得出细胞膜的
< br>
三明治结构模型
，即
蛋白质－脂
-
蛋白质。
1959
年
Robertson:
用电镜观察生物膜提出
< br>单位膜模型
，将膜的分子结构与超微机
< br>构统一起来
厚度：
2(
暗
)+3.5(
亮
)+2
（暗）
=7.5
细胞质膜的主要功能概括如下：
(1)
为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境
;
(2)
选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的
排除，其中伴随着能量的
传递；
(3)
提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；
(4)
为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；
(5)
介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接
;
质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。
2
膜蛋白
虽动物细胞主要有
9
种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白
分子数目较少，但却
赋予细胞膜非常重要的生物学功能。
根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外在膜蛋
白、内在膜蛋白。
(1)
< br>外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂
分
子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结
构并不
被破坏。
(2)
内在膜蛋白与膜结
合非常紧密，一般讲只有用去垢剂
(detergent)
使膜
解后才可分
离出来。
获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。
<
/p>
附注：使用分级抽提方法获得的
“
膜蛋白
”
中只有很少一部分是具备多跨膜区的整和膜
< br>蛋白，
膜蛋白，
到目前为止，
仍
然是蛋白组学的一个瓶颈，
不管采用２－Ｄ技术也好，
ＩＣＡＴ
乃至
proein
microarray
都还不能有效解决这一问题。
二、蛋白抽提
谈及蛋白分离，我们想到：超速离心，盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、
离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法
……
有时这些方法常常组合
到一起对特定的物质进行分离纯化。由于蛋白质种类繁多，不同的
蛋白质由于结构和
组成的差异，
其溶解度也各不相同
.
根据蛋白质的溶解特性，
同时可选择不同的溶剂
提
取，分为水溶液提取和有机溶剂提取
.
但是针对膜蛋白的提取与细胞质蛋白，核蛋白提取不同之处在于它是嵌在膜中的，水
溶性不好，基本方法就是用不同的离心速度去掉胞质蛋白等，最后用去污剂把蛋白从
膜中
释放出来。膜蛋白分离纯化的重要步骤是选择适当的增溶用表面活性剂，一般常
用的有胆
酸盐，
CHAPS(
一种离子去污剂），
Emulgen
和
Lubrol
等表
面活性剂。
1
、分离膜蛋白的方法（原则性）：
1
）
先分离
膜，然后提取；如选用冷热交替法、反复冻融法、超声破碎法、玻璃匀浆
法、自溶法和酶
处理法使得细胞破碎，然后通过剃度离心得到含有膜蛋白的粗组分。
（例如：
michael11
液氮研磨组织，加入匀浆缓冲液及蛋白酶抑制剂。差速
离心。
蔗糖密度梯度离心。收集
37%
与
41%
间的成分，即为质膜部分。裂解即可收集膜蛋
白
）
2
）用特殊的去污剂选择性的分离。
从膜上提取蛋白有许多困难
.
在多数情
况下，都
是采用去垢剂将疏水蛋白从其膜结构中溶解下来，
然后
将蛋白质稳定
.
去垢剂的选择通
常是依
据他对所需要蛋白质的提取效率来确定，但在某些情况下，还要考虑到以后的
纯化步骤<
/p>
.
虽然许多膜蛋白必须在去垢剂存在的情况下进行纯化，
但最终仍可能需要除
去去垢剂
.
这常常会引起蛋白质失活，
但如果蛋白质是用于测序的，
他将不是一个问题
.
如果不是用于测序的，
< br>可考虑使用能够黏附去垢剂的疏水珠
.
许多文献和生化试
剂供应
商的产品目录中，
都介绍有许多种不同的可用来溶解膜蛋
白的去垢剂
.
然而，
他们并不
是普遍适用的
.
在设计膜蛋白溶解方案时，必须
考虑某一去垢剂的特殊性质
.
如
triton
X-100
在
280nm
处有吸收，如果某蛋白质的测试与
2
80nm
处的吸收有关，就应避免
使用这类去垢剂
.
将膜制剂与胞质蛋白及细胞核分离后，
再进一步
从细胞膜制剂中将所需的膜蛋白增溶
下来
.
这种做法的好处是可以用强烈的去垢剂提取细胞骨架的相关蛋白，
而无需考虑胞
质蛋白、
细胞核成分或染色质成分的混入
.
使用这种方法所获得的膜蛋白，
无论在种类
上还是数量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（
<5000Da
）要多
.
一般提取的膜蛋白量
往往只
占膜蛋白总量的不足
0.1%
，所以充分的膜蛋白的提取，无疑
对于研究膜蛋白
的结构和功能都是非常重要的
.
第二种方法简单，可靠，但有时含有其他蛋白。一般
的都是利用
4
度时所有的蛋白质原则上都溶于
TritonX1
14
水溶液，在温度超过
20
度
时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂
相中。利用此性质可提取膜蛋白。
3
)
膜蛋白色谱
(Chromatography of
Membrane Protein,CMP)CMP+
分离强疏水性蛋
白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如
SDS
）溶解膜蛋白后形成
SDS-
融膜
蛋白
，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团
（
P-
端），又具有阳离子钙（
C-
端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、
SDS
结合量有关。
利用原子散射法研究
cAMP
的分离机制发现，
样品与
SDS
结合后在离子
交换柱上存在
SDS
分
子、
带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，
从而达到分级
分离的目的。
层析柱提取
/
（参步骤）
4)
< br>顺序抽提法：根据细胞蛋白溶解性的差异，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液进
行
抽提的方法。用
Tris
碱溶液裂解细胞提取高溶解性蛋白；把
未溶解的
pellet
用标准
液溶解提
取高疏水性蛋白；最后用含复合表面活性剂的蛋白溶解液，最后可以再次抽
提前两次抽提
后不能溶解的膜蛋白。
5)centrifugal
protein extraction
原理：高渗的蛋白裂解液让细胞溶涨破裂后，超高速离心
评价：
尽管分级
(
胞浆和胞膜
)
之间有清洗的步骤
,
但是可溶蛋白组分和膜蛋白组分之间
仍然有不少重复的点
.
该方法相较
MOLLOY MP
教授在
1998
年
elect
rophoresis
上发表
的分级抽提法减去了第一步
(
用
tris
抽提水
溶性蛋白
)
和最后一步
(
极难溶蛋白
),
在操作
上也
作了简化
,
总而言之是一种不错的方法。（
codegreen
）
6)detergent- based
：提取时先裂解液裂胞
膜（选用不同的去污试剂是关键），梯度
离心分离细胞器
(ER
)
，然后分级抽提方法。例如，去掉细胞器之后的
DEBRIS
就是核
膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜时不溶的部
分。
总的感受：细胞的量要很充足。之后的定性鉴定常用的方
法有双向免疫扩散、免疫电
泳及聚丙稀酰胺凝胶电泳等。纯化蛋白质浓度的定量测定可用
双缩脲法、酚试剂法或
紫外光吸收法定量鉴定膜蛋白，方便迅速。
到目前为止，提取膜蛋白仍然是蛋白学的一个瓶颈。
2
、分离膜蛋白的方法（操作）
1
）分离细胞膜蛋白的方法：
1
冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液
A
中，
于室温与液氮罐中反复
冻融
2
次。
2 5000
转
4
度离心，驱除核及未裂解的细胞。
3
< br>取上清
12000
转
4
度离心
10
分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓
冲液
B
中。
4 12000
转
4
< br>度离心
10
分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液
C
中提取后测蛋白
浓度
,SDS-PAGE
电泳，分装后
-20
< br>度保存备用。
buffer A :
1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM
DTT,0.5ug/ml
Leupeptin,20uM
pmsf(PH=7.4)
buffer B :
1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM
DTT,0.5ug/ml
Leupeptin,20uM
pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA
buffer C :
0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),
2
）分离细胞膜蛋白的方法：
1
、细胞放在冰上，去除上清，用
pH7
。
4
的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次<
/p>
2
、加入
1m
l2%TritonX
溶液冰浴
15min
< br>3
、刮下单层细胞，
4
度下
10 000g 5min
离心
4
、溶液
37
度水浴<
/p>
10min
以分离水相和去污剂相，然
后
37
度下
2
000g
离心
5min
5
、收集水相留作分析
6
、用
500ul
冰冷的<
/p>
buffer C
溶解去污剂相沉淀，冰浴
2min
后加温，在按步骤
6
再次<
/p>
离心
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