IP实验步骤

.

一

原理：

IP

是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的

“prorein A

特

异性地结合到免疫球蛋白的

FC

片段的现象活用开发出来的方法。目前多

用精制的

p rorein A

预先结合固化在

argarose

beads

上，使之与含有抗

< br>原的溶液及抗体反应后，

beads

上的

prorein A

就能吸附抗原达到精制的目

的。

< /p>

实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免

< br>染能结合未必能用在

IP

反应。

建议仔细检查抗体的说明书。

特别是多抗的

特异性是问题。

其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的 蛋白，

特别是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活

性剂的缓冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用

弱界面活性剂溶解细胞，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其

它的蛋白结合的 结果，抗原决定族被封闭，影响与抗体的结合，即使

IP

成功， 也是很多蛋白与抗体共沉的悲惨结果。

再次，

为防止蛋白的分解，

修饰，

溶解抗原的缓冲液必须加蛋 白酶抑制剂，

低温下进行实验。

每次 实验之前，首先考虑抗体

/

缓冲液的比例。抗体过少就不能检出 抗原，

过多则就不能沉降在

beads

上，

残存在上清。

缓冲剂太少则不能溶解抗原，

过多则抗原被稀释。欲速则不达，确定好比例很必要。

;.

.

IP

实验步骤

蛋白酶抑制剂的用量：

0.5%

磷酸酶抑制剂的用量：

1%

Lysis

buffer

的用量：一 般是细胞离心体积的

5-10

倍。

6< /p>

孔板加

200-300ul

左右。

基本实验步骤

（

1

）弃培养液，

PBS

清洗细胞一遍。收获细胞，加入适量细胞

IP

裂

解缓冲液（含蛋白酶抑制剂）

，冰上或者

4< /p>

℃裂解

30min

，超声破碎

，

4

℃离心，

12,000g

，

30 min

后取上清

20ul

；

（置于冰上操作）

给取的上清液中加 入

20-30ul 2

×

loading buffer.

（

2

）

取少量裂解液（

25-30ul

）以备

Western blot

。