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免疫共沉淀（
Co-
Immunoprecipitation
）
一原理：免疫共沉淀（
Co-Imm
unoprecipitation
）是以抗
体和抗原之间的专
一性作用为基础的用于研究蛋白质相互
作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内
生理性相
互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂
解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用
被保留了下来。如果用蛋
白质
X
的抗体免疫沉淀
X
，
那么与
X
在体内结合的蛋
白质
Y
也能沉淀下来。目前多用精制的
prorein A
预先结合固化在
argarose
的
beads
上，使之与含有
< br>抗原的溶液及抗体反应后，
beads
上的
prorein A
就能吸附抗
原达到精制的目的。
这种方法常用于测定两种目标蛋白质是
否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新
的作用搭
档。
其优点为：
（
1
）
相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，
处于天然状态；
（
2
）
蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，
可以避免人为的影响；
（
3
）可以分离得到天然状态的相互作
用蛋白复合物。缺点为：
（
1
）可能检测不到低亲和力和瞬间
的蛋白质－蛋白质相互作用；
< br>（
2
）两种蛋白质的结合可能不
是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；
（
3
）必须
在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所
以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险
性。
二、准备工作：
预冷
PB
S
，
RIPA Buffer
，细胞刮
子（用保鲜膜包好后，埋冰
下）
，离心机
1.
用预冷的
PBS
洗涤细胞两次，最后一次吸干
PBS
；
2.
加入预冷的
RIPA Buffer(1ml/107
个细胞、
10cm
培养皿或
150cm2
培养瓶，
0.5ml/5×106
个细胞、
6cm
培养皿、
75cm2
培养瓶
)
3.
用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，
把悬
液转到
1.5EP
管中，
4
℃，缓慢晃动
15min
（
EP
管插冰上，
置水平摇床上）
4. 4
℃，
1400
0g
离心
15min
，立即将上清转移
到一个新的离
心管中
5.
准备
Protein A
agarose
，用
PBS
洗两遍珠
子，然后用
PBS
配制成
50%
浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠
的操作中破坏琼脂糖珠
6.
每
1
ml
总蛋白中加入
100μl Protein A
琼脂糖珠
（
50%
）
，
4
℃摇晃
10min
（
EP
管插冰上，置水
平摇床上）
，
以去除非特异性杂蛋白，降低背景
7. 4
℃，
14000g
离心
15min
，将上清转移到一个新
的离心管
中，去除
Protein
A
珠子
8. (Bradford
法
)
做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，
测前将总
蛋白至少稀释
1
：
10
倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的
影响（
定量，分装后，可以在
-20
℃保存一个月）
< br>
9.
用
PBS
将总蛋白稀释到约
1 μg/μl
，以降低裂
解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则
总蛋白浓度应该稍高（如
10
μg/μl
）
10.
加入一定体积的兔抗到
500
μl
总蛋白中，
抗体的稀
释
比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异
11. 4
℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温
2h
，
激酶或磷酸
酯酶活性分析建议用
2
h
室温孵育
12.
加入
100μl Protein A
琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合
物，
4
℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温
1h
，如果所用
抗体为鼠抗或鸡抗，建议加
2 μl
过渡抗体
（兔抗鼠
IgG
，兔抗鸡
IgG
）
13. 14000rpm
瞬时离心
5
s
，收集琼脂糖珠
-
抗原抗体复合物，
去上清，
用预冷的
RIPA buff
er
洗
3
遍，
800μl/
遍，
RIPA
buffer
有时候会破坏琼脂糖珠
-
抗原抗体复合物内部的结合，
可以使用
PBS
14.
用
60μl 2&
#215;
上样缓冲液将琼脂糖珠
-
抗
原抗体
复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而
定（
60
μl
足够上三道）
15.
将上样样品煮
5min
，以游离抗原，
抗体，珠子，离心，
将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻
-20
℃，
留待以后电泳，电泳前应再次煮
5min
变性。
RIPA
Buffer
配制：
基础成分：
Tris-
HCl
（缓冲液成分，防止蛋白变性）
NaCl
（盐份，防止非特异蛋白聚集）
< br>NP-40
（非离子去污剂，提取蛋白；用
H2O
配制成
10%
储存
液
）
去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用
< br>H2O
配制成
10%
储存液；避
光保存）
注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸
钠，因
为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。
RIPA
蛋白酶抑制剂
苯甲基磺酰氟
（
PMSF
）
（用异丙醇配制成
200mM
的储存液
，
室温保存）
EDTA
（钙螯合剂；
用
H2O
配制
成
100mM
的储存液，
PH
7.4
）
亮抑酶肽（
Leupeptin
）
（用
H
2O
配制成
1mg/ml
的储存液，<
/p>
分装，
-20
℃保存）
< br>
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