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免疫共沉淀原理及实验方法
2007-03-22 16:07:46
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免疫共沉淀
一
原理：
IP
是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“
prorein A
特异
性地结合到免
疫球蛋白的
FC
片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制
的
prorein A
预先结合固化在
argarose
的
beads
上，使
之与含有抗原的溶液及抗
体反应后，
beads
上的
prorein
A
就能吸附抗原达到精制的目的。
实验最需要注意点就是抗体的性质。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能
结合未必能用在
IP
反应。建议仔细检查抗体的说
明书。特别是多抗的特异性是
问题。
其次，要注意溶解抗原的缓冲液的性质。多数的抗原是细胞构成的蛋白，特别
是骨架蛋白，缓冲液必须要使其溶解。为此，必须使用含有强界面活性剂的缓
冲液，尽管它有可能影响一部分抗原抗体的结合。另一面，如用弱界面活性剂
溶解细胞
，就不能充分溶解细胞蛋白。即便溶解也产生与其它的蛋白结合的结
果，抗原决定族被封
闭，影响与抗体的结合，即使
IP
成功，也是很多蛋白与抗
体共沉的悲惨结果。
< br>再次，为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白每抑制剂，低
温下
进行实验。
每次实验之前，首先考
虑抗体
/
缓冲液的比例。抗体过少就不能检出抗原，过多
则就不能沉降在
beads
上，残存在上清。
缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则
抗原被稀释。欲速则不达，确定好比例很必要。
(
待续
)
二
准备：
器械
#
微量高速冷冻离心机
#
移液枪
#
旋转盘
#
电泳设备
#vortex
震荡器
#
液氮及组织粉碎器
#eppentube
试剂
#
细胞或组织
#
蛋白定量
kit
#SDS
电泳试剂
< br>#
抗体
(
单抗时选择
protein G,
二抗选择抗鼠
Ig
兔血清
)
#PBS
#NaN3
#proteinA sapharose
试剂配制
抗原蛋白溶解缓冲液
缓冲液
(
最终浓度
)
1MTris-
HCL(PH7.4) 5ml (10mM)
5MNacl 15ml
(150mM)
0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)
20%TritonX-100 25ml (1%)
10%
DOC 50ml (1%)
10%SDS 5ml ( o.1%)
TLCK 18.5mg (0.1mM)
TPCK
35mg (0.2mM)
DDW 395ml
toal
500ml
另外，使用之前加
1mMPMSF(PMSF
溶在酒精，浓度
100mM
，
-20
度遮光保存。注
意不易溶于水
)
40 lysis
缓冲液
1MTris-
HCL(PH7.4) 5ml (10mM)
5MNacl 15ml
(150mM)
0.5M EDTA(PH7.4) 5ml (5mM)
20%NP40 25ml (1%)
TLCK
18.5mg (0.1mM)
TPCK 35mg (0.2mM)
DDW 450ml
toal 500ml
使用前加
1mM
的
PMSF
注意点：
*Tris
缓冲剂
PH
随温度变化，高浓度盐酸滴定时发热，冷却
后
PH
增高。
*
反复使用
PMSF
要注意保管方法
。
*1
和
2
的缓冲剂的区别在于界面活性剂。
TritonX-100,N
P40
是非离子界面活性
剂，作用温和，，
DOC <
br>EDTA
混合，离心去上清，重复二次 以下操作全在冰面或 <
br>30m
是离子性的强活性剂。注意忘记加
Trit
onX-100
，只
加
DOC
，
SDS
，可能使抗体完全失去活性。
1
的蛋白变性效果强，可能损害抗原
/
抗体结合，
2
的作用温和，却可能造成抗原溶解
不全。
*
两方都有
，
对抗原而言，
二价离
子
Mg,Ca
等是必要的。
根据自己需
要调节。
EDTA
用
NaOH
滴定。
Protocol
1
调制
protein A sapharose
protein A sapharose 5ml
溶于
20ml
含
0.
02%NaN3
的
PBS
离心
2000
转
2
分，去上清，在沉淀加
0.02%NaN3
的
PBS
，离心后去上清，重复
2
次，最后沉淀加
20ml
含
0.02%NaN3
的
PBS
，冷藏保存
用单抗做一抗时，把
protein A sapharose
先用抗鼠
Ig
兔血清处理
(
每
50ulprotein A sapharo
se
用
1-5ul
血清
)
。旋转
1-2h,
混匀后，
再离心
1-2s
去上清后，加
PBS
，
vortex
加含
0.02%NaN3
的
PBS
到原来体积，冷存。避免长期保存。
2
．抗原的检出
4
度进行
去除细胞培养液，用冷
PBS
洗一次。加
RIPA
，溶解后，转移到
eppentube
中用
vortex
混匀。
RIPA
的量：
6cm
的培养皿加
1 ml(
蛋白质
的量为
500mg/ml),
组织
块用
液氮粉碎，在缓冲剂中捣匀，蛋白定量。
，
15000rpm
离心
，上清转移到新
tube
。不用移液枪，直接从
tube
倒进另
一个
tub
e
往上清加抗体，
1ml
加
2-5ul
抗体，冷室内旋转混匀
1h
加
protein A
sapharose50ul
，再混匀
1h
5000rpm
离心
1s,
使
sapharose
沉淀，
去上清。
往
sapharose
加
RIPA
，
vortex
混
匀，离心，去上清。重复
4
次洗净。
加电泳用
sample
缓冲液
40ul,2m
煮沸，泳动后，固定
/
干燥胶，现像。
3.
注意点
A
：不熟练使用移液枪，会混入沉淀的不溶性蛋白，使实验失败。对无论怎么也
除不去的混入蛋白，只使用上清的上半部，或用超速离心机。
B
：对电泳的非特异条带，最后可依次用含
30
0mM
，
1omMNaCl
的
RIPA
洗净各一
次。
(
完
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免疫共沉淀原理及实验方法
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6]
免疫共沉淀
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一
原理：
[BR]IP
是
利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合