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时间相关单光子计数法测量荧光寿命
（一）实验目的与要求
目的
：
1
、了解时间相关单光子计数法测量荧光寿命
的原理和方法
2
、学习时间相关单光
子计数荧光光度计的使用方法
要求
：
1
、掌握时间相关单光子计数法测量荧光寿命的原理；
2
、理解荧光寿命测量在物质定性及定量分析
中的应用；
3
、了解时间分辨荧光光
光度计的基本组成，各部件的作用；
4
、学习利用
Origin
软件处理实验数据。
（二）实验原理
1
时间相关单光子计数器工作原理
TCSPC
（
Time-
Correlated Single Photon
Counting
）
是目前主要应用
的荧光寿命
测定技术。
1975
年由
PTI(Photon Technology
International)
公司首先商品化，此外，
Edinburgh
Instruments
、
IBH
、
HORIBA
等公司也在生产基于
TCSPC
的时间分辨荧
光光谱仪。
TCSPC
的工作原理如图
1
所示，光源发出的脉冲光引起起始光电倍增管产生
电信号，该信号通
过恒分信号甄别器
1
启动时辐转换器工作，时幅转换器产生一
个
随时间线性增长的电压信号。
另外，
光源发出的脉冲光通过激发单色器到达样品池，
样品产生的荧光信号再经过发射单色器到
达终止光电倍增管，由此产生的电信号经
由恒分信号甄别器
2
到达时幅转换器并使其停止工作。这时时幅转换器根据累积电
压
输出一个数字信号并在多道分析仪
(Multichannel
Analyzer)
的相应时间通道计入
一个信号，表明检测到寿命为该时间的一个光子。几十万次重复以后，不同的时间
通
道累积下来的光子数目不同。
以光子数对时间作图可得到如图
2
所示直方图
,
此图
经过平滑处理得到荧光衰减曲线。
图
1 TCSPC
的工作原理简图
图
2
时间相关单光子计数
2
荧光寿命及其含义
假定一个无限窄的
脉冲光
(
δ
函数
)
激发
n
0
个荧光分子到其激发态，
处于激发态的
分子将通过辐射或非辐
射跃迁返回基态。假定两种衰减跃迁速率分别为
Γ
和
k
nr
，则
激发态衰减速
率可表示为
dn
(
t
< br>)
dt
?
?
(
?
?
k
nr
)
n
(
t
)
其中
n<
/p>
(
t
)
表示时间
t
时激发态分子的数目，由
此可得到激发态物种的单指数衰减方
程。荧光寿命定义为衰减总速率的倒数：
τ
= (
Γ
+
k
nr
)
–
1
荧光强度正比于衰减的激
发态分子数，因此可将上式改写为
:
。
I
(
t
)
=
I
0
exp ( -
t
/
τ
)
其中
I
0
<
/p>
是时间为零时的荧光强度，
τ
为荧光寿命
。也就是说荧光强度衰减到初始强
度的
1/e
时所需要的时间就是该荧光物种在测定条件下的荧光寿命。实际上用荧光
强度的
对数对时间作图，直线斜率即为荧光寿命倒数的负值。荧光寿命也可以理解
为荧光物种在
激发态的统计平均停留时间。事实上当荧光物质被激发后有些激发态
分子立即返回基态，
有的甚至可以延迟到
5
倍于荧光寿命时
才返回基态，
这样就形成
了实验测定的荧光强度衰减曲线。
3
荧光寿命测定中的数据处理
由
于
实际
体系
的复
杂性
,
荧光
衰减<
/p>
往往
要用
多
指数
或非
指数
衰减
方
程描
述
:
I
(
t
)
?
?
i
a
i
ex
p(
?
t
/
?
)
式中
α
i
为第
i
项的指前因子。衰减方程的复
杂性反映了体系中荧光物种的多样性或
存在状态的复杂性。当所测量的荧光寿命较短时，
实验数据就和光源的脉冲宽度，
光电倍增管及电子学电路的响应时间有着密切的关系。为
了去掉仪器响应对测量结
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