各种酶切位点的保护碱基引物设计必看

各

种

酶

切

位

点

的

保

< br>护

碱

基

酶不同，所需要的酶切位点的保护碱基的数量也不同。一般情况下，在

酶切位点以外多 出

3

个碱基即可满足几乎所有限制酶的酶切要求。

在资料上

查不到的，我们一般都随便加

3

寡核苷酸近末端位点的酶切

(Cleavage Close to the End of DNA Fragments

(oligonucleotides)

为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，

NEB

< br>采用了一系列含识别序列的

短双链寡核苷酸作为酶切底物进行实验。

实验结果对于确定双酶切顺序将会有帮助

（比如在多接头上

< br>切割位点很接近时），或者当切割位点靠近

DNA

末端时 也很有用。在本表中没有列出的酶，则通常

需在识别位点两端至少加上

< br>6

个保护碱基，以确保酶切反应的进行。

实验方法：用

γ

-[

32< /p>

P]ATP

在

T4

多聚核苷酸激酶的作用下标记

0.1A

260

单位的寡核苷酸。取

1 μg

已标记了的寡核苷酸与< /p>

20

单位的内切酶，

在

< br>20°

C

条件下分别反应

2

小时和

20

小时。

反应缓冲液含

70 mM Tris-HCl (pH 7.6), 10 mM MgCl

2

, 5 mM DTT

及 适量的

NaCl

或

KCl

（

视酶的具体要求而定）

。

20%

的

PAGE

（

< br>7 M

尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。

本实验采用自连接的寡核苷酸作为对照。

若底物有较长的回文结构，

切割效率则可能因为出现发

夹结构而降低。

寡核苷酸序列

链长

C

CG

GTCGAC

CG

CCG

GTCGAC

CG G

8

10

12

G

CC

A CATGT

GG

CCC