-
RNA
的琼脂糖凝胶电泳
实验原理
RNA
电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。
非变性电泳使
用
1.0%--1.4%
的凝胶，
不<
/p>
同的
RNA
条带也能分开，但无法判断其
分子量。只有在完全变性的条件下，
RNA
的泳动率
才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定
RNA
分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速
检测所提总
RNA
样品完整性时，配制普通的
1%
琼脂糖凝胶
即可。
基本过程同
DNA
电泳一样，
但应明确
一点的是，
因为
RNA
分子对
RNA
酶的作用非常敏
感，因此必须用对
RNA
酶有抑制作用
DEPC
水来配置所有溶液
，所有与
RNA
接触的仪器和
装置都要严格处理以尽量减少
RNA
酶对样品的降解；另外，因为
RNA
分子有二、
三级结构
可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的
变性剂为甲醛和戊二醛
。
RNA
非变性琼脂糖凝胶检测
实验材料、器具及药品
蘑菇的总
RNA
溶液。
电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波
炉，紫外透射检测
仪等。
琼脂糖，<
/p>
1XTAE
电泳缓冲液，
0.5
μ
g/ml
溴化乙锭（
EB
）
10X
载样缓冲液。
实验步骤
（
1
）用
1<
/p>
×
TAE
电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加
1
×
TAE
电
泳缓冲液至液面覆盖凝胶。
（
2
）
在超净工作台上，
用移液器吸取
总
RNA
样品
4
ul
于封口膜上。
在实验台上再加入
5
ul 1
×
TAE
电泳缓冲液及
1 ul
的
10X
载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。
（
< br>3
）打开电源开关，调节电压至
100V
，使
RNA
由负极向正极电泳，约
30min
后将凝胶放
入
EB
染液中染色
5min,
用清水稍微漂洗。在
紫外透射检测仪上观察
RNA
电泳结果。
非变性电泳：
上样量超过
3ug
，
电压超过
6V/cm
，
电泳缓冲液时间太长，
均可能导致
28S
和
18S
条带分不开。
使用
2ug
上样量，电压小于
6V/cm
，使用新鲜的电泳缓冲液并且频繁混
匀两极的缓冲液，是获得好的电泳结果的前提。
(
以
DNA
标准为参照，
28S
和
18S
分别位
于
2.0kb
和
0.9kb
左右。
)
变性电泳条带变淡：
EB
与单链的结合能力要差一些，故同样的上样量，变性电泳比非变性
电泳要
淡一些。另外的可能是甲醛的质量不高。
RNA
的变性琼脂糖凝胶检测
试剂：
（
1
）
MOPS
缓冲液
（
10*
）
:0.4mol/L
吗啉代
丙烷磺酸
（
MOPS
）
(PH7.0)
，
0.1mol/L NaAc,
10mol/L
EDTA
。
（
2
）上样
染料：
50%
甘油，
1mmol/L
EDTA ,0.4%
溴酚蓝，
0.4%
二甲苯蓝。
（
3
）甲醛。
（
4
）去离子甲酰胺。
电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）——水冲洗——乙醇干燥——<
/p>
3%H2O2
灌满——室温放置
10
分钟——
0.1%DEPC
水冲洗。
操作：
（
1
）
将制胶用具用
70%
乙醇冲冼一遍，晾干备
用。
（
2
）
配制琼脂糖凝胶。
①称取
0.5g
琼脂糖，置干净的
100ml
锥形瓶中，加入
40ml
蒸馏水，微波炉内加热使
琼脂糖彻底溶化均匀。
②待胶凉至
60--70
℃，依次向其中加入
9ml
甲醛、
5ml 10X MOPS
缓冲液和
0.5
ul
溴
化乙锭，混合均匀。
③灌制琼脂糖凝胶。
（
3
）
样品准备：
①
取
DEP
C
处理过的
500
ul
小离心管，依次加入如下试剂：
10x
MOPS
缓冲液
2ul
，
甲醛
3.5
ul,
甲酰胺（去离子）
10
ul
，
RNA
样品
4.5
ul,
混匀。
②
将离心管置于
60
℃水浴中保
10
分钟，再置冰
上
2
分钟。
③
向管中加入
3
ul
上样染料，混匀。
（
4
）上样。
（
5
）电泳
：电泳槽内加入
1XMOPS
缓冲液，于
7.5V/ml
的电压下电泳。
（
6
）电泳结束后，在紫外灯下检查结
果。
-
-
-
-
-
-
-
-
-
上一篇：数字摄像机基础知识
下一篇：部分监控专用摄像机技术及参数介绍