-
.
PCR
常见问题分析及对策
(
无扩增产物、非特异性扩增、拖尾、假阳性
)
问题
1
：无扩增产物
现象：正对照有条带，而样品则无
原因
:
1
.
模板
:
含有抑制物，含量低
对样品不合适
3.
引物设计不当或者发生降解
4.
反应条件：退火温度太高，延伸
时间太短
对策
:
1
.
纯化模板或者使用试剂盒提取模板
DNA
或加大模板的用量
2.
更换
Buffer
或调整浓度
3.
重新设计引物（避免
链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物
4.
降低退火温度、延长延伸时间
问题
2<
/p>
：非特异性扩增
现象：条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带
原因：
1.
引物特异性差
2.
模板或引物浓度过高
3.
酶量过多
2+
浓度偏高
5.
退火温度偏低
精品
6.
循环次数过多
对策：
1.
重新设计引物或者使用巢式
PCR
2.
适当降低模板或引物浓度
3.
适当减少酶量
4.
降低镁离子浓度
5.
适当提高退火温度或使用二阶段
温度法
6.
减少循环次数
.
精品
.
问题
3
：拖尾
现象：产物在凝胶上呈
Smear<
/p>
状态。
原因：
1.
模板不纯
不合适
3.
退火温度偏低
4.
酶量过多
、
Mg
2+
浓度偏高
6.
循环次数过多
对策：
1.
纯化模板
2.
更换
Buffer
3.
适当提高退火温度
4.
适量用酶
5.
适当降低
dNTP
和镁离子的浓度
6.
减少循环次数
问题
4
：假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
原因：
靶序列或扩增产物
的交
*
污染
对策：
1.
操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心
管外；
2.
除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管
及加样枪头等均应一次性使用。
3.
各种试剂最好先进行分装，然后
低温贮存
PCR
产物的电泳检测时间
一般为
48h
以内，有些最好于当日电泳检测，大于
< br>48h
后带型不规则甚致消失。
精品
.
假阴性，不出现扩增条带
PCR
反
应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，
④
PCR
循环条件。寻找原因亦应针对上述环节
进行分析研究。
模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有
Taq
酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消
化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或
吸入
酚。⑤模
板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩
增带，极有可能是标本的消化处
理，模板核酸提取过程出了毛
病，因而要配制有效而稳定
的消化处理液，其程序亦应
固定不宜随意更改。
酶失活
：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而
导致假阴性。需注意的是有时忘加
Taq
酶或溴
乙锭。
引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是
P
CR
失败或扩增条带不
理想、容易弥
散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条
引物一条浓度
高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单
位。②引物的浓度不仅要看
OD
值，更要注重引物原液做琼
脂糖凝胶电泳，一定要有
引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引
物无条
带，此时做
PCR
有可能失败，应和引物合成单
位协商解决。如一条引物亮度高，一条
亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存
，防止多次冻融
或长期放冰箱冷藏部分，导致引
物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不
够，引物之间形成二聚体等。
Mg2+
浓度：
Mg2+
离子浓度对
PCR
扩增效率影响很大，
浓度过高可降低
PCR
扩增的特
异性，
浓度过低则影响
PCR
扩增产量甚至使
PCR
扩增失败而不出扩增
条带。
反应体积的改变：通常进行
PCR<
/p>
扩增采用的体积为
20ul
、
30ul
、
50ul
。或
100ul
，应用多
大体积进行
PCR
扩增，是根据科研和临床检测不同目
的而设定，在
做小体积如
20ul
后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。
物理原因：变性对
PCR
扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出
现假阴性
;
退火温度过低，可致非特异性扩增而降
低特异性扩增效率退
火温度过高影
响
引物与模板的结合而降低
PCR
扩增效率。有时还有必要用标准
的温度计，检测一下
扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温
度，这也是
PCR
失败的原因之一。
靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异
性结合，或因靶序列某
段缺失使引物与模板失去互补序列，其
PCR
扩增是不会成功的。
假阳性
出现的
PCR
扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。
引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性
，因而在进行
PCR
扩增
时，扩增出的
PCR
产物为非目的性的序列。靶序
列太短或引物太短，
容易出现假阳
性。需重新设计引物。
靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交
叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心
轻柔，防止
将靶序列吸入加样枪内或
溅出离心管外。②除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或
器
材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使
用。③必要时，在加标本
前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的
小片段核酸污
染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性
。
可互相拼接，与引物互补后，可扩
增出
PCR
产物，而导致假阳性的产生，可用巢式
PCR
方法来减轻或消除。
出现非特异性扩增带
PCR
扩
增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带
与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列
不
完全互补、
或引物聚合形成二聚体。二是
Mg2+
离子浓度过高、退火温度过低，及
PCR
循环次数
过多有关。其次是酶的质和量，往往
一些来源的酶易出现
非特异条带而另一来源的酶
则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：
精品
.
①必要时重新设计引
物。②减低酶量
或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次
< br>数。④适当提高退火温度或采用二温度点法
(93
℃变<
/p>
性，
65
℃左右退火与延伸
)
。
出现片状拖带或涂抹带
PCR
扩
增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量
差，
dNTP
浓度过高，
Mg2+
浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引
起。其对
策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少
dNTP
的浓
度。③适当降低
Mg2+
浓
度。④增加模板量，减少循环次数。
克隆
PCR
产物的最优条件是什么？
最佳插入片段：载体比需实验确定
。
1
：
1
（插
入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比
1
：
8
或
8
：
1
也行。应测定比值范围。连接用
5ul
2X
连接液
, 50ng
质粒
DNA,1Weiss
单位的
T4
连接酶，插入片段共
10ul
。室温保温
1
小时，或
4oC
过夜。
在这
2
种温度下，缺
T-
凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温
1
小时能
满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需
4oC
过夜。
PCR
产物是否需要用凝胶纯化？
如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引
物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高
比例的带有引物二聚体的克
隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。
如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？
A
）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产
生氨苄抗型的菌落。
B
）转化完整质粒，计算菌落生长数
，测定转化效率。例如，将
1ug/ul
质粒
< br>1:100
稀释
,1ul
用于<
/p>
100ul
感受态细胞转化。用
SOC<
/p>
稀释到
1000ul
后，用
100ul
铺
板。培养过夜，
产生
1000
个菌落。转化率为：
产生菌落的总数
/
铺板
DNA
的总量。
铺板
DNA<
/p>
的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。
具体而言转化用
10ng
DNA
，用
SOC
稀释到
1000u
后含
10 ng DNA
，用
1/10
铺板，共用
1 ng DNA
。转化率为：
1000
克隆
X10
（
3
次方）
ng /
铺板
1 ng DNA ug
=10
（
6
次方）
cfu/ ug
转化
pGEM-T
应用
10
（
8
次方）
cfu/ ug
感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受
态细胞的转化率太低。
C
）如用
p
GEM-T
正对照，或
PCR
产物，产
生
>20-40
蓝斑（用指定步骤
10
（
8
次方）
c
fu/ ug
感受态细胞），表明载体失去
T
< br>。可能是连接酶污染了核酸酶。
T4 DNA
连接酶（<
/p>
M1801
，
M1804
，
M1794
）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它
来源的
T4 DNA
连接酶替换。
D
）用
pGEM-T
或
pGEM-T Easy
载体，连接
pGEM-T
正对照，转化高频率感受态细胞（
10
（
8
次方）
cfu/ug
）
,
按照指定的实验步骤，可得
100
个菌落，其中
60%
应为白斑，如产生
>20-40
蓝斑
,
没有菌落或少有菌落，连接有问题。
对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？
A
）连接用室温保温
1
小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需
4oC
过夜。<
/p>
B
）插入片段带有污染，使
3`-T
缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和
pGEM-T
正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯
化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使
pGEM-T
或
pGEM-T Easy
载体
3`-T
缺失。
C
）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受
UV
过度照射，时有发生。
UV
< br>过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接，
DNA
必需重
新纯化。
D
）带有
修复功能的耐热
DNA
聚合酶的扩增产物末端无
A
，后者是
pGEM-T
或<
/p>
pGEM-T
Easy
载体克隆所需。加
Taq DNA
聚合酶和核苷酸可在末端加
A
。
详
情查
pGEM-T pGEM-T Easy
载体技术资料（<
/p>
TM042
）。
E
）高度
重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠
杆菌菌株，如
SURE
细胞
PCR
疑难解答
当
PCR
结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行
：
将
PC
R
反应的试管与反应板紧贴。
当酶反应混合物以
70
℃“热启动”开始循
环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在
0.2-ml
的<
/p>
PCR
管中不能均匀传热。
不要随意减少
dNTP
的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。
对于有问题的
PCR
反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加
Taq
酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常
PCR
扩
增。
没有扩增产物：
< br>在提供
MgCl2
缓冲液中，以
0.25mmol/L
为梯度增加
MgCl2
< br>浓度；无
MgCl2
的缓冲液以
0.5 mmol/L
为梯度增加
MgCl2
< br>浓度。
精品
.
泳
道中出现模糊条带，如果
DNA
模板中存在
RNA
，则按上述提示浓度补加
MgCl2
，因为在
PCR
反应中可能缺少游离的
Mg2+
。
检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。
检查模板和引物的用量。
增加循环次数和
/
< br>或模板
DNA
的用量。
泳道中出现模糊条带：
减少循环次数或模板
DNA
的用量。
提高退火
温度，但不要超过
68
精品
.
℃。
重新设计引物或设计更长的引物。
其他值得注意的条件：
建议使用
0.2-ml
薄壁管。厚壁管在
92
℃时不能有效地使模板变性。
最佳反应体积为
50ml
，推荐用
30ml
矿物油覆盖（对盖子加热的
PCR
仪可以不加）
。
大多数反应中，
0.75ml
（
0.5~1ml
）的酶量在大多数情
况下可以得到满意的结果。
建议使用
1.75mmol/L
MgCl2
∶
350mmol/L
dNTP
或
2.25mmol/L
MgCl2
∶
500mmol/L dNTP
< br>组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化
Mg2+
的浓
度是必需的。
基因组
DNA
模板的质量显著影响
PCR
< br>反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测
DNA
的长度
。
DNA
片段长度可以超过
50kb<
/p>
，传统的基因组
DNA
能扩增片
段至
10kb
。
要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的
< br>DNA
。请查阅高分子量
DNA
提取操作过程相关文献。
降低二级
结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段
PCR
扩增时，引
物长度一般为
24~34
个核苷酸，溶点在
60~68
℃间。使用这类引物可提高
PCR
反应的退
火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往
受到非特异性短片段优先扩增的影响。
变性：第一步变性在
94
℃下进行
2
分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（
94
℃下进行
20--30
秒）
，除非模板中富含
GC
，则
95
℃下变性
30
秒。这可以防止
DNA
脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组
DNA
片段终长度超过
12
kb
时，应该尽可能的降低变性温度。
延伸：
68--
72
℃下进行延伸操作。
循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若
PCR
仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增
10kb
片断
时，延伸时间用
10
分钟替代原来的
8
分钟。
长
片断
PCR
系统扩增的片断其
3’
-
末端带有一个突出的
A
< br>，因此建议采用
T/A
克隆。若要进行平端可隆，可用<
/p>
Klenow
酶和
T4 DNA
多聚酶将
PCR
产物补平后
再进行。
测序时因酶的混合物
带有
3’→5’外切酶活性，用
Sanger
< br>方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。
引物设计：
一般长度
20-30bp
；
至少
50%
的
GC
含量；
避免引物二聚体和二级结构；
引物对的
Tm
值应该接近。
也可下列图示提示找到解决问题的突破口：
精品
.
PCR
实验操作程序
1.
在无菌的
0.5ml
或
0.2ml
离心管中按下列操作程序加样：
反应物
加样顺序
体积(μl)
终浓度
去离子水
1 29.4
10×Buffer B 2 5 1×
4×dNTP
混合物
3 5
各
200μmol/L
MgCl
2
4 3 1.5mmol/L
有义引物
5 2.6
0.25μmol/L
反义引物
6 2.6 0.25μmol/L
模板
7 2
0.1μg
TaqDNA
聚合酶
8 0.4 1unit
2.
用微量可调加样器和一次性
Tip
向每
一管中加
50μl
矿物油。每加一管换一次
Tip
。
3.
振荡每只管，然后短暂离心。
4.
将管放到预热的热循环中，按下列程序开始循环：
预变性
94
℃
4
分钟
1
次
精品
-
-
-
-
-
-
-
-
-
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