-
A
细胞交联与溶解
实验前准备
1
；处理过的细胞，
80-90%150mm
培养皿，内含
20ml
培养液
?
1-2 x 107
cells
可以分成十份，即每份
1-2x106
2
；预冰
1XPBS ml
（
step3
）
,
培养皿预冰（
step6
）
3
；准备
42
mL
1X
PBS
(4.2
mL
10X
PBS
and
37.8
mL
water)
for
each
150 mm
培养皿并放于冰上。用于洗涤。
4
；
SDS Lysis
Buffer
于室温，使有助于细胞溶解
5
；
Protease
Inhibitor Cocktail II
于室温下，
st
ep3
和
13
会用到。
使用完后需放回
-20
℃。
1
；加
550ul
的
37%
甲醛到
20ml
培养液里交联，
轻轻漩涡混匀。
2
；室温孵育
10min
3
；同时，每个培养皿准备
2ml P
BS
于管子里放在冰上
,
每
1mlPBS
加
5ulProtease
Inhibitor Cocktail II
4
；每个培养
皿加
2ml
的
10xGlycine<
/p>
，终止交联
5
；混匀，室温下孵育
5min
6
；培养皿放于冰上
7
；尽量吸进培养皿中的液体，注意不要损伤到细胞
8
；加
20ml
冰的
PBS
洗涤细胞
9
；吸去
PBS
，再重复用
PBS
洗涤一次，吸去
PBS
。
10
；加
2ml
步骤
3
准备的<
/p>
PBS
11
；用细胞刮棒将瓶底的细胞
刮下，收集到
1.5ml
的离心管中
12
；
700 X g
于
4
℃离心
2-5min
，以沉淀细胞
13
；离心期间，准备溶解液——每
1mlSDS Lysis
Buffer
内添加有
5ulProtease
Inhibitor Cocktail II
?
For every 1 x 107 HeLa cells, 1 mL of
SDS Lysis Buffer is
recommended.
不同细胞具体分析。
14
；
去上清（此步的细胞可以保存在
-80
℃）
15
；
加入
1 mL
步骤
13
准备的
溶解液，重悬细胞。
16
；分装到离心管里，每个管
3
00-400ul
（这步的溶解产物可以冻存
于
-80
℃）
17
；若超声条件优化好了，则接下来做超声裂解，反之，按照附录优
化。
B
超声波裂解法剪切
DNA
实验前准备
最优的剪切条件为
DNA
约
200-1000
< br>碱基对
1
< br>；如有必要，将
A
中
step1
6
的溶解产物做琼脂糖凝胶分析未剪切的
DNA
；若
step16
中的溶解产物冻存，则先于冰上解冻
2
；超声裂解，使
< br>DNA
长℃保持在
200-1000bp
之间，保持样本在冰上。
3
；
4
℃离心（
10
，
000-15
，
000
）
x g 10 min
，以去除不能溶解的物
质
.
吸取的
是上清，弃掉的是沉淀。
4
如有必要
，准备
5ul
做琼脂糖凝胶分析剪切的
DNA
?
准备琼脂糖凝胶分析，
join
the
protocol
in
Appendix
A
at
Step
7.
5
< br>；
去上清液于新的离心管中，每管
100ul
?
每
100
ul
包含
1 x 106 cell equivalents
of
lysate
，就足够做一
次免疫沉淀
?
剪切交联的染色质可保存于
-80
℃超过两个月
C
交联的
D
NA
免疫沉淀
实验前准备
取出
Protease Inhibitor
Cocktail II
，于室温下解冻，用于
step3
。
使用完后放置与
20
℃保存。
1
；准备足够的
Dilution
Buffer
包含
protease inhibitor
?
每个
IP
需要添加
900ul Dilution Buffer
和
4.5ul of Protease
Inhibitor Cocktail II.
?
IP
实验需要
the
positive control (Anti-RNA Polymerase
II)
和
the negative
control
(Normal Mouse
IgG)
以及抗体
2
；准备一个离心管，里头包含有
100 ul of
剪切的交联染色质
(
即
Section
B, step 5)
，置于冰上。如果染色质是冻存的，那么先在冰
< br>上解冻。
?
如果需要
N
个免疫实验，
则准
备染色质的要求是一样的，
需将所需
N
倍的液体放置于一个大的管子里。
?
每
100ul
包含
1 x 106
细胞等价的染色质
3
；加
900 ul of
Dilution Buffer containing 4.5ul Protease
Inhibitor Cocktail II
于每个包含
100ul
染色质的管中。
?
如果需要
N
个免疫实验，需将加入所需
N
倍的液
体。
4
；加入
60ul Protein
G Agarose,
每个
IP
。
?
Protein
G
Agarose
是一个
50%
的悬浮液。轻轻颠倒混匀
后在吸取。
?
这一步是用来预处理染色质的，如减少非特异性背景。
5
；
4
℃，摇动孵育
1
小时
6
；短暂离心
3000-5000 x
g 1 minute 4
℃
.
?
离心不要太高速，否则或琼脂糖珠子受压迫，使珠子不一致
<
/p>
7
；
吸去
10u
l
（
1%
）
上
清液作为
Input
，
保存在
4
℃，
直到
Secti
on
D,
step
1.
?
如果是不同的染色质，则要准备不同的
Input
8
；
收集剩
余的上清液，分装成
1ml
在新的离心管里。弃去琼脂糖珠
子
9
；加抗体到上清部分
?
For
the
positive
control,
anti-RNA
Polymerase,
加
1.0
ug
of
抗体每管
.
?
For the
negative control, Normal Mouse IgG,
加
1.0 ug of
抗
体每管
.
?
For user-
provided antibody and
controls,
加
between 1-10ug
of antibody
每管。具体量以经验为主。
10
；
4
℃，摇动孵育，过夜
< br>
?
是否缩短孵育时间，取决
于很多因素（抗体，目的基因，细胞类
型等等），这需要经验。
11
；加入
60uL of
Protein G Agarose
每
IP
< br>，
4
℃，摇动孵育
1
小时
?
这步用来收集
antibody/antigen/DNA
complex.
12
；短暂离心
Protein G
Agarose(3000-5000 x g
，
1
minute)
，弃
去上清液。
13
；用下列
冷的
缓冲液洗脱
Protein G Agarose-antibody/chromat
复合物，每次
1ml,
按顺序洗，每次
摇动孵育
3-5min,
短暂离心
(3
000-5000 x g
，
1
minute)
，并小心的移去上清液。
a
. Low Salt Immune Complex
Wash Buffer (Catalog #
20-154),
一次
b
.
High
Salt
Immune
Complex
Wash
Buffer
(Catalog
#
20-155),
一
次
c
. LiCl Immune Complex Wash
Buffer (Catalog # 20-156),
一次
d
.
TE Buffer (Catalog # 20-157),
二次
D<
/p>
洗脱蛋白质
/DNA
复合物
实验前准备
?
1
M
NaHCO3
于室温下，此时可观察到有沉淀物，但到室温后溶
解。
1 M
NaHCO3
可以涡旋混匀。
?
设置水浴锅温℃
< br>65
℃，用于
setionE
1
；配置新鲜洗脱缓冲液，用于
IP<
/p>
管和
Input
管（
SetionC,step7
）
?
每管准备
200ul
的洗脱液：
10 uL 20% SDS,
20uL 1 M NaHCO3 and
170 uL
无菌双蒸水。
2
；准备一个大的容量可包容所有的管的量。如有
10
管混合
，则共需
105 ul
2
0%
SDS, 210 ul
1
M NaHCO3 and 17
85ul
无菌双蒸水（即要
计算损耗量）
3
；
For Input
tubes (see Section C, step 7),
加
200uL of
洗脱
液
，放置于室温下直至
Section E.
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