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染色质免疫沉淀
(Chromatin immunoprecipit
ation)
（
ChIP
）
1.
细胞交联、裂解
准备：
42ml
1
×
PBS(4.2ml
10
×
PBS+37.8ml
water)[
预冷
]
SDS
lysis Bufer
放置室温
Protease inhibitor
cocktail
Ⅱ置室温
新鲜配制
37%
甲醛
(1).
向已长满细胞的
10cmDish
中
（含
10ml
培养基）加入
275ul
37%
甲醛，轻轻
混匀，室温静置
10
min
(2)
．
< br>同时，准备
2
个
EP
管，每管中吸取
1ml
预冷的
1
×
PBS
，在分别加入
5ul
protease inhibitor cocktail
Ⅱ
,
放置冰上。
(3)
．
加入
1ml
10
×
Glycine
于每个
Dish
中，以中和多余的甲醛。
(4)
．
旋转混匀，室温放置
5min
(5)
．
将
Dish
放置冰上
(6)
．
弃去培养基，尽可能吸尽培养基，不要损伤细胞。
(7)
．
加
10ml
预冷的
1
×
PBS
洗细胞
(8)
．
弃
PBS
，再重复洗一遍
(9)
．
加
1ml
预冷
PBS
（含有
1 ×
Protease inhibitor c
ocktail
Ⅱ）与
Dish
中（<
/p>
2
步准
备好）
(10)
．将细胞刮下来，收集至
EP
管中。
(11)
．
700g
，
4
℃，
离心
2-5min
，使细胞沉淀
下来。
(12)
．
在离心过程中，准备
lysis
buffer(1ml
SDS
lysis
Bufer
中加入
5ul
Protease
inhibitor
cocktail
Ⅱ
)
一般
1
×
10
7
Hele cell,
用
1ml
SDS lysis Bufer
(13)
．
弃上清（细胞沉淀物可冻存与
-80
℃）
(14)
．
1ml SDS(
含
1
×
Protease inhibitor coc
ktail
Ⅱ
)
重悬细胞沉淀物
(15)
．
分装
300-400 ul
每管（细胞
裂解液可在
-80
℃保存）
(16)
．
超声
2.
超声剪切
DNA
(1)
．
分
装
5ul
细胞裂解液，用于琼脂糖凝胶电泳（
< br>unsheared DNA
）
(2)
．
冰上放置细胞裂解液，超声剪切
DNA
注：
（
摸条件，
超声时要将细胞裂解
液放置冰上，
超声时产生大量热，
会破坏
DNA
）
(3)
．
离
心
10000-15000g
，
4
℃，
10min
，
去除不容物
(4
）
．
<
/p>
取
5ul
琼脂糖凝胶电泳（
sheared DNA
）
(5)
．
将
余下上清分装于新的
EP
管中，每管
1
00ul
注：
（每
100ul
中包括
1
×
106
个细胞，
可以用作一次免疫沉淀用量）
剪切后的染
色质可以储存与
-80
℃<
/p>
2
个月久。
注
意：超声条件，
1
×
10
7
/ml
超声
4-5
次，每次
10s.
超声仪为
50w
模型，
2mmtip,
设置成最大能量的
30%
3.
immunoprecipitation of crosslinked protein/DNA
准备：将
Protease inhibitor
cocktail
Ⅱ放置回复室温
(1)
．
准备含有
Protease inhibitor
cocktail
Ⅱ的
Dilution buffer
准备做
IP
用
注：
（每个
IP
需
900ul Dilution buffer+4.5ul Protease
inhibitor cocktail
Ⅱ）
阳性对照
阴性对照
实验组
推荐阳性对照与实验组抗体最好用同一物种
(2)
．
准备含有
100ul sheared
DNA(3
管
)
冰上融化
(3)
．
向
每含有
100ul chromatin EP
管中加入
900ul
含有
P
rotease inhibitor
cocktail
Ⅱ的
dillution buffer
(4)
．
向
每个
IP
管中各加入
60ul
proteinG/A agarose
注：
（使用前先轻轻混匀）
(5)
．
4
℃孵育
1h
(6
）
．
4
℃离心
3000-5000g
1min
(7)
．
取出
10ul
作为
input,
放于
4
℃
注：
（如果不同批次
的染色质混在一起，需将每个染色质取出
1%
作为
input
）
(8)
．
将
上清液吸至新的
EP
管中，弃去
aga
rose
(9)
．
向上清液中加入相应的抗体
(
一般抗体
1-10ug)
(10)
．
4
℃孵育过夜
(11)
．
向各组中
EP
管中加入
60ulpro
teinG/A agarose
，
4
℃孵育
1h
(12
）
．
离心
3000-5000g
，
1min
弃上清液
(13)
．
清洗
proteinG/A
agarose-antibody/chromatin complex
加入清洗液后在水平摇床上孵育
3-5min,
然后离心
3000-5000g
1min
小心去除上
清液
a Low salt complex wash buffer
洗一次，
1ml
b High salt immune complex wash
buffer,
洗一次，
1ml
c Lici immune complex wash buffer
洗一次，
1ml
d TE buffer
洗两次，每次
1ml
4.
洗脱
protein/DNA
complexs
准备工作：
1M NaHCO3
回复至室温。
（可能有结晶，可用涡旋器混匀）
(1)
．
准备
Elution buffer
(
共四管
)
（阳性对照、阴性对照、实
验组、
input
）每个
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