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大肠菌群检测技术研究进展

作者:高考题库网
来源:https://www.bjmy2z.cn/gaokao
2021-02-02 18:37
tags:

-

2021年2月2日发(作者:特易购)







研究生课程论文













:















:








:








:





2010



12



28









:




































































































































































































2010116089



























大肠菌群检测技术研究进展




摘要



大肠菌群是一群革兰氏阴性无芽孢杆菌 ,国内外都以其作为食品、水体


污染的常用指示菌之一。本文详细归纳了检测大肠菌群多 管发酵法、膜过滤法、


酶底物法、


聚合酶链式反应技术、


荧光原位杂交技术、


自动化检测方法等的各自


的优缺点及研究进展,


并认为今后一段时间内大肠菌群检测新技术将与传统方法


并存,在新技术支持下的精确、快速、可靠、环保、低廉的检测仪器将会被研发

< br>和得到应用与普及。



关键词


:


大肠菌群;检测技术;研究进展



Progress in Study of Detection Technology for Coliform


Group


Abstract:



The coliform group is


a group of non- Bacillus gram-negative bacteria,


and it is one of indicator bacteria that are commonly used in food, water


pollution for both at home and abroad. This


article concludes the process and


recent advances of testing coliforrms, including multiple-tube fermentation,


membrane filter, enzyme substrate technique, polymerase chain reaction, fluorescent


in situ hybridization and automation, and comparing their advantages and


disadvantages. On this basis, we maintain that traditional methods and new


technologies will coexist. Supported by new technology, the accurate, celerity,


reliable, environmental and low detection equipment will be researched, applied and


popularized.



Key words:



coliform group; test


technology


; research progress




大肠菌群是一群 在


37


℃、


24 h


能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧


的革兰阴性无芽胞杆菌



1,2




这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致,


但动



(


包括人类


)


的排泄物是其主要来源,且与肠道病原菌的生活能力接近,


< /p>


我国


和世界其他各国广泛地采用其作为饮用水受粪便污染的指标,



推断有无肠道致


病菌污染的可能,


< /p>


评价其卫生质量



3~5



。人们对大肠菌群检测技术的研究越来


越多


,


要求越来越高


,


目前国内外现行的检测技术主要有以下几种


:


1.


传统方法



传统方法主要包括多管发酵


(multiple-tube fermentation ,MTF)


技术和膜过滤


(membrane filter ,MF)< /p>


技术。这两种技术普遍得到世界各国的批准应用


,


例如具有


代表性的美国环保局


( EPA)


和法国标准化联合会


(FSA)


分别在


20


世纪

90


年代


批准在本国实施


,


并制定了相应的判别标准。






1.1


多管发酵技术







多管发酵技术被用作大肠菌群检测至今已有


80


年的历史


,


其原理是依据大


肠菌群能够发酵乳糖、产酸、产气的特点


,


将样品进行系列倍比稀释


,


分别接种


到含有乳糖培养液的试管中


,



36


±


1


℃培养


24 h,


观察产酸、


产气情况


,


完成初


发酵试验。阳性样本还需进行确认试验


[6]




该方法优点是不需昂贵的仪器设备


,


经过基本微生物学培训的技术员即可


操作。


缺点是乳糖发酵管的 制作耗时费力


,


检测样品都需要做系列稀释

,


加上后续


确认试验大约需要


96 h


以上


,


而且属于半定量试验


,


其技术特点决 定了该法有


时还会低估样品中大肠菌群的数量甚至造成漏检。



由于传统的多管发酵法费时费力,在水样多及时间紧的情况下,越来越不



能满足实际监测的需要,已经有研究者建立了一种快速检测的新方法


[6]


,即在初


发酵管中加入一定浓度的革兰氏 阳性菌抑菌剂和显色剂,


直接依据产酸产气及溶


液颜色的变化,


推算出水样中大肠菌群的含量。


通过大量对比实验,

< p>
结果证明该


方法准确性较好,


与传统的多管发酵法 进行比对,


两种方法所测结果经统计学检


验无显著性差异。



1.2


膜过滤技术



膜过滤技术已在许多国家作为水质微生物检测的标准方法


,


核心是使用


0.45


um


的过滤膜过滤水样


,


将细菌截流在膜上


,


然后把膜放在选择性培养基中培养


,


计数膜上生长出的典型细菌集落。


不同国家和地区使用的选择性培养基有所不同


,


如北美的


m- Endo


型和欧洲的


Tergitol- TTC



,


大肠菌群在含有乳糖的


m- Endo


型上生长出带有金属光泽的红色菌落


,


而在


Tergitol-TTC


中则为橙黄色菌落


[7]





膜过滤技术属于定量试验


,


具有许多和试管发酵技术相同的优点


,


膜过滤技


术比试管发酵技术最明显的优越性是滤膜法具有高度的再现性


,


非常便于检测较


大体积的水样


,


这样就能增加检出的敏感性和可靠性。缺点是特异性不高


, < /p>


结果


容易受水样中其他细菌的影响而出现误判

,


也需结合进一步的确认试验才能最


终确定结果。


膜过滤技术存在的最主要问题是饮用水常常因为消毒处理使其中的


大肠 菌群受到损伤


,


这种应激和损伤的大肠菌群无法在选择性培养基 上生长出菌


落。







滤膜过 滤与荧光技术相结合


,


可用来检测大肠菌群

[8]


,


即采用能被


β

< p>


- GAD



水解产生强荧光物


4 -


甲基伞形酮


(4- Mu)



4-


甲基伞形基


-


β< /p>


-


半乳糖苷


(


简 称


MUGAL)


为底物


,


与滤膜技术相结合


,


使大肠菌群在微孔膜上形成特殊 的荧光斑点


,


以此来定量检测饮用水及公共用品中的大肠菌群。 此法亦能在定性鉴别上


,


与能


产生荧光 色素的假单胞菌相区别


[9]




2.


酶底物法



与传统方法相比


,


微生物酶谱分析法 具有更好的特异性


,



根据所检测酶类 的


不同


,


可以分辨出大肠菌群的群


(group)




(genus)




( species) ,


反应也更加快


速、敏感


,

< br>因此关于此技术能否用于大肠菌群的检测已有多年的探索。



酶底物法



enzyme substrate technique



采用大肠菌群细菌 能产生


β


-


半乳糖

< br>苷酶(


β


- D- galactosidase




分解


ONPG



Ortho- nitro phenyl-


β


- D-


gala ctopyranoside



使培养液呈黄色,


以及大肠埃希氏菌产生


β


-


葡萄糖醛酸酶



β


- glucuro nidase



分解


MUG

< p>


4- methyl- umbelliferyl-


β


- D- glucuronide



使培养液




在波长


366nm


紫外光下产生荧光的原理,来判断水样中是否含有大肠菌群及大


肠埃希氏菌。< /p>



酶活性检测法比传统方法省时省力


(1 8



24h) ,


而且特异性更高。缺 点是试剂


花费较高


,


而且与传统方法一 样不能解决无法培养的大肠杆菌的检出难题。因为


水中的消毒剂以及培养体系中可能存在 的一些抑制因子都可能使大肠杆菌受损


,


使大肠杆菌失去增殖和 酶合成的能力。



2000



Van Poucke



[10]



将固相激光细胞扫描仪用于饮用水大肠菌群的酶


活性检测。首先将水样过滤


,


使细菌截留在


014


μ< /p>


m


孔径的滤膜上


,

然后诱导膜上


的大肠杆菌表达


β


-


葡萄糖醛酸酶


,


再应用荧光发光底物< /p>


,


使表达


β


-< /p>


葡萄糖醛酸酶


的大肠杆菌着染荧光


,


用固相激光细胞扫描仪扫描即可


,


整个过程 只需


315h


。该法


的敏感性可达到检 出一张滤膜上的一个荧光着染的大肠杆菌。


染好的滤膜也可在


落 射光荧光显微镜下观察着染的大肠杆菌。



3

< br>.


分子生物学方法



大多数分子 生物学方法不需要培养步骤


,


因此可以在几个小时内完成


,


目前常


用的检测饮用水大肠菌群的分子生物 学方法主要有聚合酶链反应


(PCR)


法和荧


光原位杂交


( FISH)


法。



3.1 PCR





聚合酶链式反应


( polymerase chain reaction ,PCR)


由美国


Cetus



公司的


Mullis


等于


1985


年提出


,


是近年来分子生物学领域中迅速发展和广泛应用的一


种技术。


PCR


技术能够快速、特异地在体外扩增人们所需要 的目的基因或


DNA


片段


,


是基因扩增技术的一次重大革新


,


它可以将极微 量的


DNA


特异性地扩增上


百万倍。近 年来


PCR


技术在环境微生物检测中获得了广泛的研究和应用


[11]




大肠菌群中普遍存在



LacZ



基因



( ?


-


半乳糖苷酶基因



)


[12]


和大肠杆菌的



UdiA



基因


( ?


-D-


半乳糖苷酶基因



)


,利用


PCR


技术扩增编码约



260 bp LacZ



因和约



150 bp


UidA



基因的



DNA


片段,可以分别检测大肠菌群数和大肠杆菌


[13]




最常用的


PCR


法是与


MF


法结合在一起的


,


首先将膜上截留的细菌用化学方


法裂解


,


释放出


DNA ,


再在相应的引物引导下用


Taq


酶 扩增出产物


,


通过电泳条


带染色或再与 相应探针杂交判定结果。


PCR


法已有多年用于食物、泥土等 样品


微生物检测的历史


,


但最近才有用 于饮用水检测的报道


[14]


。除普通


PCR



,


其他

PCR


方法也被用于水样中大肠菌群的检测。筑巢法


PCR


已经用于饮用水中


E.


coli


和某些微生物的检测。近年来研制的实时荧光定量


PCR


实现了


PCR


从定性


到定量的飞跃


,


与常规


PCR


相比具有特异性更强、能有效解决


PCR

污染问题、自


动化程度高等特点


,


目前已得到广泛应用。



引物设计是饮用水大肠菌群检测的难点


,


因为聚合酶链式技术


( polymerase


chain reaction



PCR )


水中 微生物种类众多


,


必须要设计高特异性引物方能从中检


出大肠菌群


,


而不出现假阳性。


基于编码


β


-


半乳糖苷酶的< /p>


lacZ


基因的引物已经用


于饮用水大 肠菌群检测的


PCR


法。还有基于编码


β


-


葡萄糖醛酸酶的


uidA



基因


和编码麦芽糖转运蛋白的


malB


基因的引物


,


但这些引物在应用中不仅 能扩增出


大肠菌群


,


也能扩增出志贺氏 菌和沙门氏菌等。其中基于


uidA



基因的引物能扩增



MUG


阴性的


O157



H7 ,


表明只要具有此种基因的大肠菌即能被检出


,


而基因


是否表达并不重要


,


这 就比酶法具有更高的敏感性和更低的漏检率。



PCR


方法是一种特异性高的检测和鉴定方法


,


但尚 存在一定的不足


,


如不能


-


-


-


-


-


-


-


-



本文更新与2021-02-02 18:37,由作者提供,不代表本网站立场,转载请注明出处:https://www.bjmy2z.cn/gaokao/601984.html

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