-
一、
ChIP
实验步骤
第一天：
（一）
、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1
、取出
1
平皿细胞（
10cm
平皿）
，加入
243
ul 37
％甲醛，使得甲醛的终浓度为
1
％。
（培养基共有
9ml
）
2
、
37
摄氏度孵育
10min
。
< br>
3
、终止交联：加甘氨酸至终浓度为
0.125M
。
450ul 2.5M
甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置
5min
即可。
4
、吸尽培养基，用冰冷
的
PBS
清洗细胞
2
次。
5
、
细胞刮刀收集细胞于
1
5ml
离心管中
（
PBS
依次为
5ml
，
3ml
和
3ml
）
。
预冷后
2000rpm
5min
收集细胞。
6
、倒去上清。按照细胞量，加入
SDS Lysis Buf
fer
。使得细胞终浓度为每
200ul
含
2
×
106
个细胞。这样每
100ul
溶液含
1
×
106
个细胞。再加入蛋白酶抑制剂
复合物。
假
设
MCF7
长满板为
5
×
106
个细胞。本次细胞长得约为
80
％。即为
4
×
106
个细胞。因此每
管加入
400ul SDS
Lysis Buffer
。
将<
/p>
2
管混在一起，共
800ul
。
7
、超声破碎：
VCX750
，
25
< br>％功率，
4.5S
冲击，
9S<
/p>
间隙。共
14
次。
（二）
、除杂及抗体哺育。
8
、超声破碎结束后，
10
，
000g 4
度离心
1
0min
。去除不溶物质。
留取<
/p>
300ul
做实验，其余
保存于－
80
度。
30
0ul
中，
100ul
加抗体做为实验
组；
100ul
不加抗体做为对照组；
100ul
加入
4ul 5M NaCl
（
NaCl
终浓度为
0.2M
）
，
65
度处理<
/p>
3h
解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
9
、在
100ul
的超声破碎产物中，加入
900ul ChIP Dilution B
uffer
和
20ul
的
50
×
PIC
。
再各加
入
60ul
Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA
。
4
度颠转混匀
1h
。<
/p>
10
、
1h
后，
在
4
度静置
10min
沉淀，
700rpm
离心
1min
。
11
、取上清。各留取
20ul
做
为
input
。一管中加入
1ul <
/p>
抗体，另一管中则不加抗体。
4
度颠
转过夜。
（三）
、检验超声破碎的效果。
取
100ul
超声破碎后产物，加入<
/p>
4ul 5M NaCl
，
65
度处理
2h
解交联。分出一半用酚
/
氯仿抽
提。电泳检测超声效果。
< br>
第二天：
（一）
、免疫复合物的沉淀及清洗。
12
、孵育过夜后，每管中加入
60u
l Protein A Agarose/Salmon Sperm
DNA
。
4
度颠转
2h
。
13
、
4
度静置
10min<
/p>
后，
700rpm
离心
< br>1min
。除去上清。
1
4
、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在
4
度颠转
10min
，
4
度静
置
10min
沉
淀
，
700rpm
离
心
1min
，
除
去
上
清<
/p>
。
洗
涤
溶
液
：
a.
low salt wash buffer----one wash b. high salt
wash buffer-----one wash
c. LiCl wash
buffer------one wash d. TE buffer------two wash
15
、
清洗完毕后，
< br>开始洗脱。
洗脱液的配方：
100ul 10
％
SDS
，
100ul
1M NaHCO3
，
800ul ddH2O
，
共
1ml
。
每管加入
250ul
洗脱
buffer
，室温下颠转
15m
in
，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。
最终的洗脱液为
每管
500ul
。
16
、解交联：每管中加入
20ul
5M NaCl
（
NaCl
终浓度为<
/p>
0.2M
）
。
混匀，
65
度解交联过夜。
第三天：
（
一）
、
DNA
样品的回收
17
、
解
交联
结
束
后
，
每管
加
入
1ul RNaseA
（
MBI
）
，
37
度孵
育
1h
。
18
< br>、
每
管
加
入
10ul 0.5M EDTA
，
20ul 1M
（
PH
6.5
）
，
2ul 10mg/ml
蛋白酶
K
。
45
度处理
2h
。
19
、
DNA
片段的回收―――
omega
胶回收试剂盒。最终的
样品溶于
100ul ddH2O
。
（二）
、
PCR
分析
二、技术总结
（一）
、关于细胞
细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状
态直接影响细胞内部的基因表达调控网
络，也很有可能影响你所研究的
TF
与其靶
Promoter
的结合。
一
般细胞长到
75
％－
80
％比较好。
（二）
、关于抗体！
抗体是实验成败的致命因素之一！必须是
IP
级别
的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽
量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和
santa cruz
的抗体，即使是
IP
级别的。
单抗与多抗的选择也需要仔细
考虑。
两种抗体各有利弊。
单抗特异性强，背景低。
但是单抗
有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在
ChIP
甲醛交联的过程中，很有可能该位点被
其它蛋白或
核酸结合而被封闭，
导致单抗不能识别靶蛋白。
多抗虽然没有这
个问题，
但是多
抗特异性较差，背景可能会偏高。
一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合
的区域）
，选择多抗
比较稳妥一些。
（三）
、关于交联与超声破碎！
这一块的确是
ChIP
实验中比较难把
握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联
的程度越高，超声破碎就越不易把
基因组打碎成小片段。
交联不充分，只有一部分靶蛋白
与其
Promoter
相结合，富集得到的
Promoter
的量不高，实验假阴性。交联过充分，基因组
上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。
一般来讲，
按照我的经验，
交
联条件取决于细胞类型。
不同的细胞系，
交联的条件也不一样。
例如：
NIH
－
3T3
的交联条件是室温（
25
摄氏
度）下
15min
，
1
％的甲醛浓度，而别的细胞系
则可能完全不一样。
而超
声破碎的条件，
机器不一样，
条件也不一样。
< br>当然如果你有
bioruptor
这样的神器，那么超声
破碎对你而言就是小菜一碟了。
一般，
< br>理想的超声破碎得到的片段大小是
200bp
－
1000bp
。
但是
2
00bp
－
2000bp
的范围也是<
/p>
可以接受的。
（四）
、关于操作
希望尽可能的保持低温（
4
度）
。
沉淀的时候可以先在
4<
/p>
度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（
500rpm
等）离心使
其完全沉降。
虽然说明书上说
ChIP
实验的过程中有几个可以
停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做
完，直到
PCR
结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。
（五）
、关于解交联
虽然说明书上说
4
小时已经足够，
但是我还是希望你可以解交联过夜。
因为在那样的环境里，
DNA
不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在
E
P
管口封上封口膜。
（六）<
/p>
、关于
DNA
片段的回收
需要注意的是：样品中
SDS
< br>样品较高，普通的
PCR
产物回收试剂盒回收，很有可能
会在最
终的样品中混入
SDS
，影响<
/p>
PCR
实验结果。
小
Tip
：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能
有效的消除
SDS
沉淀
二、
ChIP
是一项比较流行的研究转录因子（
transcription factor, TF
）
与启动子（
promoter
）相互结合的
实验技术。由于
ChIP
采用甲醛固定活细胞或者组织的方
法，所以能比较真实的反映细胞内
TF
与<
/p>
Promoter
的结合情况。这个优势是
EMSA
这个体外
研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能
比拟的。
当用甲醛处理时，
相互靠近的蛋白与蛋
白，
蛋白与核酸
（
DNA
或
RNA
）
之间会
产生共价键。
细胞内，
当
TF
与
Promoter
相互结合
< br>（生
物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲
醛处理，能使
它们之间产生共价键。
一般
ChIP
的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破
碎——加入目的蛋白的抗体，与
靶蛋白
-DNA
复合物相互结合——加入
Protein A
，结合抗
体
-
靶蛋白
-DNA
< br>复合物，并沉淀—
—对沉淀下来的复合物进行清洗，
除去
一些非特异性结合——洗脱，
得到富集的靶蛋白
-DNA
-
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