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1
．
为什么需要新鲜的菌液？
首先，新鲜
的菌液易于培养，可以获得更多的
DNA
，同时最大限度地保证
菌种的纯度
.
2
．
如何提供菌液？
如果您提供新鲜菌液
，
用封口膜封口以免泄漏；
也可以将培养好的
< br>4
—
5ml
菌液沉淀下来，
倒去上清以方便
邮寄。同时邮寄时最好用盒子以免邮寄过程中压破<
/p>
.
3
．
如何制作穿刺菌？
用灭菌过
1.5ml
或
2ml
离
心管加入
LB
琼脂
(7g/L)
斜面凝固，用接种针挑取分散良好的单菌落穿过琼脂直达
管底，不完全
盖紧管盖适当温度培养过夜，然后盖紧盖子加封口膜，室温或
4
度保存。
4
．
PCR
产物直接测序有什么要求？
<
/p>
1)
．扩增产物必须特异性扩增，条带单一
.
如果扩增产物中存在非特异性扩增产物，一般难以得到好的测序
结果；
.2
）必须进行胶回收纯化；
3
）
DNA
纯度在
< br>16
—
2.0
之间
.
浓度
50ng/ul
以上
.
5
．
<
/p>
为什么
PCR
产物直接测序必须进行
Agarose
胶纯化？
如果不进行胶纯化而直接用试剂盒回收，经常会导致测序出现双峰甚至乱峰。这主要是非特异性扩增产物
或者原来的
PCR
引物去除不干净所导
致。
大多所谓的
PCR
纯化试剂盒
实际上只是回收产物而不能起到
纯化的作用的。对于非特异性扩增产物肯定无法去除，而且通常他们不能够完全去除所有的
PCR
引物，这
会造成残留的引物在测序反应
过程中参与反应而导致乱峰。
6
．
如何进
行
PCR
产物纯化？
PCR
产物首先必须用
Agarose
胶电泳，将特异扩增的条带切割下，然后纯化。使用凝胶回收试剂盒回收
.
产
物用
ddH2O
溶解。
7
．
PCR
产物直接测序的好处？
A)
PCR
产物直接测序可以反映模板的真实情况
.
B)
省去克隆的实验费用和时间
.
C) PCR
产物测序正确的片段进行下一步克隆实验使结果更
有保障
.
D)
混合模板进行
PCR
的产物直接测序可以发现其中的点突变
.
8
．
对
用于测序的质粒
DNA
的要求有哪些？
对测序模板
DNA
的一般要求：
1).DNA
纯度要求高，
1.6
—
2.0
之间，不能有混合模板，也不能含有
RNA
，
染色体
D
NA
，蛋白质等；
2).
溶于
ddH2O
中，溶液不能含杂质，如盐类，或
E
DTA
等螯合剂，将干扰测序
反应正常进行。
< br>
9
．
如何鉴定质粒
DNA
浓度和纯度？
我们使用水平琼脂糖凝胶电泳，并在胶中加入
0.5ug/ml
的
EB(
电泳缓冲液中不必加
EB)
，加一个已知浓度
的标准样品。电泳结束
以后在紫外灯下比较亮度，判断浓度和纯度。此方法可以更直接、准确地判断样品
中是否
含有染色体
DNA
、
RNA
等，也可以鉴别抽提的质粒
DNA
的不同构型。<
/p>
质粒
DNA
的
3
种构型是指在抽提质粒
DNA
过程中，由于各种原因的影响，使得超螺旋的共价闭合环状结
构的质粒
(SC)
的一条链断裂，变成开环状
(
OC)
分子，如果两条链发生断裂，就变成为线状
(L)
分子。这
3
种
分子有
不同的迁移率，通常，超螺旋型
(SC)
迁移速度最快，其次为
线状
(L)
分子，最慢为开环状
(OC
)
分子。
使用紫外分光光度计检测，或者用溴乙锭
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标准浓度
DNA
比较法只
能检测抽提到的产物中的浓度，甚至由
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