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iTRAQ
技术需注意的问题与答疑
1
．
Itraq
的原理是什么？
Itraq
的检测
可以做这样的比喻，
蛋白被打成肽段后，
被平均的铺在了一个有
384
个孔的平板上，
然后机器会从每
个孔中选取浓度在前
5
名的蛋白进行鉴定和比对，
所以，
如果假设每个一个样本中有
100
个蛋白，他们的浓度均为
1%
，那么得到的结果就
是蛋白的得分低，但是鉴定的蛋白数量会很多，
可以达到
90<
/p>
以上；如果一个样本中有
100
个蛋白，
有
3
个蛋白的含量分别为
30
、
20
、
10
、其他的
97
钟蛋白为剩下的
< br>50%
，那么这三种蛋白的得分高，但是鉴定出的蛋白数量会比较少，也许只有<
/p>
50
或
者
60<
/p>
个。因为一些高丰度的蛋白会大量分部在上述的小孔中，抑制了其他蛋白的检出效果。
2
．
iTRAQ
的主要优势是什么？
(1)
高通量。一次性定性和定量该样本的总蛋白，不用像双向电泳（
2DE
）或
DIGE
要逐个斑点做
鉴定；
2DE
可分离
1500-2500
个斑点
(
并且可能很多斑点对应同一种蛋白
)
，
而
iTRAQ
一般可鉴定
2
000
种以上蛋白，其中常规动物组织或细胞可鉴定到
4000
-7000
种蛋白；
(2)
结果直观、分析灵活——直接得到蛋白的定性和相对定量信息，可利用统计学方法快速筛选
出各个组别的差异蛋白；能更好的结合基因组或转录组的数据，十分有利于后续研究。
(3)
对样本类型无限制——任何类型的样本
均可做，当然数据库越全、鉴定到的蛋白种类越多；
对于罕见物种，可提供转录组数据来
检索，更容易找到有意义的蛋白。
(4)
一次上机的样本数高达
8
个，如果样本数多于
8
个，还可以在每次上机时设置内参，每个样
本先跟
内参比较，
再相互比较
（排除操作、
环
境和仪器误差）
，
从而实现多组样本间的差异蛋白分析。
3
．
iTRAQ
与其他蛋白质组学技术有何不同，我们该如何选择？
双向电泳是最早、最经典的蛋白质组技术，适用于大部分样本，只是对强
酸或强碱性蛋白，
以及
分子量太大或太小的蛋白质分离效果不好
；
另外由于各个样本需要单独跑胶，
很难避免操作误差对结
果的影响，
可能导致定量不准确；
但是双向
电泳的服务价格相对便宜，
可以用于样本差异的初步筛选；
<
/p>
DIGE
在双向电泳基础上做了改进，引入了荧光标记物和内标，
可以使定量更加准确；但该技术也是
依据蛋白的等电点和分子量分离，
< br>因此对强酸或强碱性蛋白，
以及分子量太大或太小的蛋白质分离效
果也不好。
iTRAQ
、<
/p>
TMT
、
label-free
和
SILAC
都是利用液质联用技术来寻找差异
蛋白。其中，
iTRAQ
和
TMT
的原理和检测方法基本一致，只是使用了不同的标记物；
TMT
有
10
种标记物，可对多达
10
种不同样
本进行分析，但是由于其标记物的质量数非常相近，因此必须使用超高分辨率的质谱（
Thermo
公司
的
QE<
/p>
质谱仪）
才可以满足检测，
这也必然会导
致信号干扰更多，
可能会影响定量的准确性；
label-fr
ee
是非标记的蛋白质组学技术，
由于没有标记物，
其定量需要依赖于操作和质谱仪的稳定性，
该技术鉴
定到的蛋白数目会少于
iTRAQ
技术，并且定量的准确性较
差，优势是服务费用较低；
SILAC
是基于稳
定同位素标记的细胞培养技术的蛋白质组学方法，利用不同的同位素培养基来培养不同组别的细胞，
达到体内标记的目的，
其定量准确性要比其他蛋白质组学技术更高；
但是由于缺乏合适的同位素培养
基，该方法基本只能用于可传代
的哺乳动物细胞系。
从定量准确性、应用性等各方面综合考虑，
iTRAQ
技术已成为近年来利用最广泛的蛋白质组学
技术。
4
．
iTRAQ
实验对样本有何要求
?
任
何类型的样本都可以，
如果是罕见物种，
可以用近缘物种的数据
库检索，
也可提供转录组数据
库来检索；
一次上机，每组样本需要用
200ug
蛋白，但由于需要蛋白
定量检测和预实验，因此每组样
本所需的蛋白量大概在
500u
g
左右；我公司负责蛋白质的提取，客户只需要提供足够的原始样本。
< br>
5
．不同类型的样本做
iTRAQ
可否一次上机？
不能。
如果样品来源于不同物种，检索时就无法选择数据库，
也就无法分析数据；
即使是同一物
种的样本，它们的蛋
白种类和丰度也可能有很大差别（比如植物的根和叶）
，将这些酶切肽段混合上
机，其数据会相互干扰，导致蛋白定性和定量的不准确。
6
．
iTR
AQ
实验是否需要设置重复？
我们常
说的重复包括生物学重复和技术重复，
iTRAQ
中常说到的还
有上机重复；生物学重复即样
本重复，
采集来源于同一组别的不
同样本
（例如同样处理的不同植物、
同一疾病的不同患者血清等
）
，
通常设置
3
个生物学重复，
但临床样本一般要求生物学重复更多
（如疾病
组和健康组各十几例样本）
；
当生物学重复的样本很多时，可以
将同组样本混合后再标记，便可以通过一次上机检测；技术重复，
通常是同一个样本用不
同标记物标记，这样可以排除因蛋白提取、
酶解、标记等操作引入的误差；另
外
ITRAQ
实验有时会设计上机重复，
这其实也属于技术重复的范畴，
即相同的样本上两次机，
来排除
操作误差和仪器误差。目前发
SCI
论文一般需要设置重复（无论何种重复）
，否则可能会被质疑数据
的准确性；另外从数据质量上讲，重复能更有效的帮助我们排除不可信蛋白，无论是对
WB
验证还是
后续研究，都是很有利的。
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