-
一、体外肝细胞损伤模型建立
(CC
ｌ
4
与
H2O2)
?
1
大鼠肝细胞得分离与培养
大鼠
4
％戊巴比妥麻醉
,
门静脉插管
,
先以无钙灌流液灌流
,<
/p>
继以
3
７
℃
通入Ｏ２得
Ⅳ
型胶原酶灌流液继续循环灌流
15 min
。
将肝脏移至一平皿内<
/p>
,
轻轻
撕去肝包膜后
,
加入含
5
％小牛血清得清洗液<
/p>
,
用吸管吹打成单个肝细胞悬液
,
２
00
目尼龙网
过滤
,
低速离心
(
５
0
０
r·
mi
ｎ
-1,1 m
< br>ｉｎ
,4
℃
)
< br>弃上清
,
同法用清洗液反复洗
3
次、
然后用
完全
1640
培养液
(
内含
10
％小牛血清
,10
５<
/p>
U·
L
－
1
青霉素
,1
０<
/p>
0 mg·
L
—
1
链霉素与
10
mg·
L-1
胰岛素
)
制成１
×
109
个
·
L-
１肝细胞悬液、分离得肝细胞经
0
、
6%
台盼蓝拒染法
测得细胞活力大于９
0
％
,
高碘酸雪夫反应显示糖原法鉴定
9
９％为肝实质
细胞。
将上述肝细胞悬液分别加入
２４孔
(
每孔１
m
ｌ
)
与
96
孔
(
每孔０。１
< br>
ml)
培养板中
,
置３
７
℃
,5%CO2<
/p>
培养箱中培养。１
2
～１
6 h
后可见肝细胞贴壁于培养板孔底上生长、
?
2
CCl4
诱导肝细胞坏死性损伤模型得建立
肝细胞培养
12 h
后
,
吸弃上清
,
更换培养液并加
入不同浓度得ＣＣ
l4
〔
(1
～
1
６
m
ｍｏｌ
·
Ｌ
-1),
以少量得二甲亚砜助溶
,
二甲亚砜终浓度为
0
、
1
％
(
体积分数
)
〕
,
作用不同时间
(1
～
12
h)
后
,
收集
２
4
孔板中培养上清检测
AST
,
以及
肝细胞得
MD
A
含量与Ｇ
SHp
ｘ活性
;
同步测定
96
孔板中培养
肝细胞得
MTT
反应。根据检
测结果制
备
C
Ｃｌ
4
诱
导肝细胞损伤得量效与时效曲线、
选择最造损伤浓度与损伤时间制备
肝细胞得损伤模型
,
同时设溶媒对照组
,
每组至少设３个复孔、
３
H2O2
诱导肝细胞坏死性损伤模型得建立
同法更换培养液
,
加入不同浓度得
H
２<
/p>
O2(
０
.
２～
３。
2
ｍ
mol·
< br>Ｌ
—
１
),
作用不同时间
(0
、
5
～
4
h)
后
,
收集
24
孔板中培养上
清
检测
A
Ｌ
T
,
测定肝细胞得
MDA
含量
;
同步测定９６孔板中培养肝细胞得
MTT
反应。根据检
测结果制备
H2
Ｏ
2
诱导肝细胞损伤得量效与
时效曲线
,
选择最适损伤浓度与损伤时间制备
< br>肝细胞得损伤模型
,
同时设溶媒对照组
< br>,
每组至少设
3
个复孔。
?
4
检测指标
?
(1)
AST
< br>、
ALT
得测定
培养得肝细胞经离心
(1 800
<
/p>
ｒ
·
ｍ
i
ｎ
-1,1
０
m
ｉｎ
)
后收集上
清
,
按试剂盒说明书步骤测定上清液中
AST
与
(
或
)ALT
活性
,
结果以
U·
(
１
06
cell)-1
表示、
(2)
肝细胞增殖试验
采用
MT
Ｔ比色法、
?
?
(
３
)
肝细胞谷胱
甘肽过氧化物酶
(GSH
ｐ
x)
活性得测定
先制备
GSH
标准曲线。弃肝细胞培养上清
,
加入
0
、２％
Trit
ｏ
n
－
100
水
溶液
0
< br>。
5
ｍｌ
,
< br>混匀
,
２
min
后
,
离心
< br>(2
500
ｒ
·
m
ｉ
n-
１
,1
０
< br>ｍ
in),
取上清液
(
肝细胞
样品
)0.4
ml,
另设样品空白管
,
非酶反应管与
试剂空白管
,
加入各种试剂。混匀后立即计时
< br>,
静置１
2 min
后
,
以样品空白管调零点
,
于
42
３
nm
波长处读得吸光度
(A)
值。
在
GSH
标准
曲线
上查出对应得ＧＳ
H
波度。
G
Ｓ
Hpx
酶活力单位就是在
3
７
℃
,pH6
< br>、５条件下
,
每
106
个肝细胞、每分钟使
GS
Ｈ浓度下降１
μ
ｍｏｌ为１个酶活力单位。计算公式为
:GSHpx
活力单位
=(
［
G
Ｓ
H
］非酶管－［
GS
Ｈ
]
样品管－［Ｇ
SH
］试剂空白管
< br>)/3
。结果以Ｕ
·
(10
６
ｃｅ
l
ｌ
)-1
表示。
?<
/p>
(4 )
肝细胞丙二醛
(M
Ｄ
A)
含量得测定
先制备
M
Ｄ
A
标准曲线。弃肝细胞培养上清
,
加入生
理盐水
1
ｍ<
/p>
l,
混匀
,
移入
离心管中
,
离心
(2 500
r·
min
－
1,1
0
mi
ｎ
),
弃上清
,
加
15
％
TCA
２
m
ｌ
,
破坏细胞并沉淀蛋白质
,
加入
0.
６
7%
T
Ｂ
A
２
ml,
于
沸水浴中加热
3
０
< br>m
ｉ
n
。
根据样本得吸光度值在标准曲线上查出对应得浓度
,
结果以<
/p>
nmol·
(
１
06
ｃ
el
ｌ
)
—
1
表
示。
?
(5)
数据处理
数据以
±
s
表示
,
计量资料组间比较采用
t
检验。两变量间相互关系
,
采用直
线相关与回归分析。
?
二、体内肝损伤模型
(
酒精
)
?
１、材料
纯系
SD
雄性大鼠
,
体重
180g
～２
00 g,
由浙江大学医学院实验动物中心提供。
食
用酒精选用北京酿酒总厂出品得
56
度红星二锅头。
?
2
、
方法
<
/p>
将大鼠随机分成
5
组
,
饲养在
23
℃
< br>~
２５
℃
室内
< br>,
自由进食、
进水
;
根据大鼠体重
,A
、
B<
/p>
、Ｃ、
D
组每日用
56°
红星二锅头白酒以
1
０
m
ｌ
/1K
ｇ分别灌
胃
0
、４周、
8
周与
12
周
;E
组于酒精灌胃１
2
周后
,
停止灌胃
4
周。大鼠
通过股动脉采血处死
,
收集血浆与肝脏标
本、
3
?
?
、主要指标检测
?
?
(
１
)
肝功能
:
应用日立
7170
自动生化分析仪测定总蛋白
(
Ｔ
P)
、白蛋白
(Al
ｂ
)
、球蛋
白
(
Ｇ
lb)
、丙氨酸氨基转移酶
(A
ＬＴ
)
与天冬氨酸氨基转移酶
(AS
Ｔ
)
等。
?
(2)
氧化抗氧化物质测定
:
采用南京建成生物工程研究所提供得试剂盒分别检测丙二醛
(MDA)
< br>、谷胱甘肽过氧化酶
(GS
Ｈ
-
Ｐ
x)
、谷胱甘肽
(GSH)
、超氧化物歧化酶
(S
ＯＤ
)
与谷
胱甘肽－
< br>S
－转移酶
(GST)
。
?
(3)
大鼠肝脏
病理检查
:
大鼠处死后立即取出肝脏
,
称重后一部分以１
0
％得福尔马林液固
定作病理
,
作常规石蜡切块并
H
Ｅ染色
,
在光学显微
镜下进行观察
,
用半定量法分别判定脂肪
变性、及酒精性肝炎炎症活动度
三、四氯化碳体外损伤肝细胞模型
?
原代培养得正常大鼠肝细胞培养
2
４ｈ
(
贴壁良好
)
后
,
置培养皿于一密闭得塑料盒
,
内置四
氯化碳
0
、
４Ｍ容积
,37
度
90
ｍ
i
ｎ
,
造成肝细胞损伤得模型
,
后转入正常培养
< br>,
进行下一步实
验。
(
即熏蒸法
)
?
肝细胞培养
1
２
h<
/p>
后
,
吸弃上清
,
更换培养液并加入
C
Ｃ
L4 8mM(
事先用
DMSO
溶解
,DMSO
终浓度
1%),
作用６
h
后收集
2
4
孔板中培养上清检测
AS
Ｔ以及肝细
胞
M
Ｄ
A
含量
盒
GS
Ｈ
ｐ
x
活性
,
评价损伤程度。
(
常用方法
)
?
?
四、醋氨酚体外损伤肝细胞模型
肝细胞培养
24h
< br>后
,
用清洗液洗
2
次
,
培养液洗
1
次
,
然后换以２
0mM<
/p>
醋氨酚得培养液
,
继续
< br>培养
1
２
h,
< br>取培养液
,
进行下一步实验。
?
五、过氧化氢体外损伤肝细胞模型
?
肝细胞培养２
4h
后
< br>,
吸弃上清液
,
更换培养液并加
入
H
２
O2
０
.
６
mM,
作用１
h
后
,
收集２
4
孔板中得培养上清液检测Ａ<
/p>
ST
活性与
MDA
含量、
六、氰化钾缺氧肝细胞损伤模型
<
/p>
肝细胞培养
24h
后
,
贴壁生长良好得肝细胞中加入氰化钾
2.5mM,
继续培养
2
ｈ
,
定量检测
培养液上清中
LDH
活性
,
以及酶得活性反应肝细胞损伤程度、
本模型可以更好得模拟缺氧损
伤。
?
七、硫代乙酰胺
(TTA)
体外肝细胞损伤模型
?
肝细胞预
培养
24h
后
,
贴壁生长良好得肝细胞中加入
TTA0.18m
Ｍ
,
继续培养
48h,
肝细
胞大
量损伤与坏死
,
上清液中乳酸脱氢
酶
(LD
Ｈ
)
活性升高
,
造成体外损伤肝细胞模型。
?
?
八、
内
毒
素体外损伤肝细胞模型
?
贴壁生长良
好得肝细胞中加入内毒素
70uL/m
Ｌ
,
置３７度
,5
％
< br>C
Ｏ
2
培养此时上清ＬＤ
H
活性升高造成肝细胞损伤模型
,
造成体外肝细胞损伤模型、
?
< br>九、半乳糖胺
(G
ａｌ
N)
体外损伤模型
分离肝细胞
,
预培养
12
—
24
ｈ后
,
待细胞贴壁生长均匀后
,
加入
5m
Ｍ
GalN
得肝细胞培养液
,
继续培养
1.5h,
测定培养上清液中
AL
Ｔ
,ALT
显著升高时
,
肝细胞造模成功。
?
?
十、帕金
森体外模型
体外培养得中脑多巴胺能神经元
M<
/p>
Ｐ
TP
损伤模型
?
?
l
实验操作
:
实验采用胚胎龄
14
一
16
天得大鼠
,
剖子宫取
胎
,
取胎鼠中脑腹侧区。
可将多个胚胎
来源得组织收集在一起
,
置
F
ｌ
2
培
养基
(
Ｇｉｂ
co)
至３
5
ｍ
m
得培养皿中
,
以细剪刀剪碎。将
2ml
含
0
、１２
5
％得胰酶得
F1
２加入到组织中
< br>,
该混合物于３
7
℃
孵育
1
０分钟后
,
加入
DNase I(Si
ｇ
ma)
至终浓度
80
ｎ
g
／
m
１
,
继续于
3
７
oC
孵育
1
０分钟、消化
后得组织以尖端被火抛光得移液管轻轻吹打
8
次。
该细胞悬液以种植培养基稀释
(
种植培养基
:
MEM,
补充以<
/p>
2
ｍ
m
谷氨酰胺
,6mg/m
ｌ
葡萄糖
,1m
ｇ
/
ｍ
l
谷胱甘肽
,
１
0
ｕｎｉ
t
ｓ
/m
ｌ青霉素
,10ul/ml
< br>链霉素与
7.5
％胎牛血
清
)
。细胞然后种植于
3
５
mm
得预先以
10ug
／
m
１
ｐ
o
１
y1y
ｓｉ
ne (Sigm
ａ
)
与
2
。
5ug
／
m
ｌ
mer
ｏｓ
in(Ch
ｅ
mi
ｃｏ
n)
< br>铺底得培养皿中
,
种植密度为５
0,0
０
0
细胞／
cm
２。培养
16
小时后
,
培养基换为无血清培养基。该培养基为
F1<
/p>
２与
ba
ｓ
a1
E
ａ
g1e's
m
ｅ
d
ｉ
um,
补充以
33mM
葡萄糖
,2mM
谷氨酰胺
,
１
5
m
Ｍ碳
酸氢钠
,
１
0
ｍ
M
Ｈ
EPE
Ｓ
(pH7.0),1
ｕ
g/ml<
/p>
谷胱甘肽
,20u
ｇ
/
ｍ
l
胰岛素
,
100
ｕ
g/ml
转铁蛋白
,
６０ｕＭ腐
胺
,20nM
孕酮
,20nM
亚硒酸钠
(NaSe)
,3
０
nM
三碘甲状腺原氨酸
,0
、
5
unit/ml
青霉素
与
0
、
5m
ｇ
/
ｍ
l
链霉素、
?
毒物处理
:
于第
4
天以
1uMMP+
处理
48
小时、然后进行分析。
?
模型评价
:
< br>倒置显微镜下观察细胞形态、细胞计数、免疫组化检测
T
Ｈ阳性细胞得数目与
形态。
?
体外培养得中脑多巴胺能神经元６
—
OHDA
损伤模型
?
采用上述方法选择胎鼠
,
分离中脑腹侧部
,
解剖显微镜下仔细剔除脑膜与血管
,
用高糖
T
—
Ｂ
SS
反复冲洗涤之七遍。并将组织剪碎
,
移入
0
。
25%
< br>胰蛋白酶溶液中
,37
ｏ
C
振荡消化
3
０
分钟
,
后加入血清数滴终止消化
,
用吸管轻轻吹打后
,
加入不含血清得
DME
Ｍ培养液混匀
,1
０
00rp
ｍ
,10
< br>ｍ
in
离心收集细胞
,
反复
2
次
,
后加入含血清得完全
D
ＭＥＭ培养液悬浮细胞
,
过
220
目不锈
钢筛网使成单细胞悬液
,
计数后将约３
×
１０
6
个细胞接种人事先涂有多聚赖
氨
酸得
35mm
得六孔培养板中
,
置３
7oC
、
5
％
C
Ｏ
2
培养箱中培养。
2
４
小时后待细胞完全贴
壁时
,
置换旧培养
液
,
以后每隔
2
天更换一次培养液。培养至第六天时加入
100uM
得
6-
Ｏ
HDA
处理<
/p>
3
小时后吸出、在相应备孔中加入完全
D
Ｍ
EM
培养液洗涤２遍
,
再加入完全
DMEM
培养液
继续置
5
％
C
Ｏ
2
培养箱中培养
24
小时
,
采用与上述相同得方法做免疫细胞化
学染色
,
计数
T
Ｈ阳性细胞
,
确立
6<
/p>
—
ＯＨＤ
A
对体
外培养得多已胺能神经元得损伤作用。
?
十一、Ａ
β
损伤模型
取出生１
-
２
d
得乳鼠
,
用麻醉剂处死。在
D
－
hanks
液中取大脑并分离海马组织
,
胰蛋白酶
消化
,
获得细胞悬液
,
胎盘蓝染色进行死活细胞记数
,
将
细胞以５
×
1
０５
/
ｍ
l
得密度接种于预
先经
L-
多聚赖氨酸处理得
9
６孔与２
4
孔培养板
,
其中
24
孔板中预先放置
有盖玻片。细胞
维持在培养液中
,
置入
5
％ＣＯ２
,
饱与湿度得培养箱中培养
,24h
后全换液
,
接种当天为第一
天
,
每
3d
半量更换培养液一次
,
培养第
3
天时加入阿糖胞苷
,
终浓度为
10μmo
ｌ／
L,
以抑制
神经胶质细胞得过度
增殖
,
２
4h
后更换全部培养液继续培养
,
第
1
０天进行细胞造模
,
开始实
验。
?
也可以用
PC
１２细胞株
,
常规培
养
?
?
Ａ
β<
/p>
产物诱导海马神经细胞
,
建立细胞模型<
/p>
:
?
选择Ａ
β
25
-3
５片段
,
用三蒸水配制成１
0
０
μmol?
？Ｌ－
1,
过滤
,
分装
,-2
０
℃
冻存
;
使用
前老化处理并配制成所需浓度。
(
将Ａ
β2
５
-35
溶解在Ｄ
MS
Ｏ中
,
在用ＤＭ
EM
稀释
,
置于<
/p>
37
℃
下孵育
7
-14
天
,
即为老化状态
)
、
-
-
-
-
-
-
-
-
-
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