-
在
小
肠
，
杯
状
细
胞
< br>传
输
抗
原
到
树
突
状
细
胞
CD103
+
肠
道免疫系统接触到外来的混合物中，抗原来自饮食、共生的植物和潜在的病原体。
了解特
异性免疫病原是怎样引发的，在无关痛痒的背景下避免发生不恰当的反应
。对
理解和治疗肠道感染和炎症性疾病，抗原是必不可少的。树突状细胞
(dc)
能诱导肠道对
摄入蛋白质抗原产生
耐受性
,
这是提高
T
cells
免疫的一部分。固有层
(LP)
在大量的吸收
绒毛状上皮细胞之下，
吸收细胞包含
大量的树突状细胞
(CD11c
+
CD
11b
+
MHCII
+
cells)
主要
由
CD10
3
+
CX3CR1
-
DCs
两个组成
,
它能促进<
/p>
IgA
生产、
印在肠道淋巴细胞上和调节
T
细
胞的发展。
CX3CR1
+
、
CD103
-
DCs
(
带有巨噬细胞的特征
),
促进肿瘤坏死因子（
< br>tnf- a
）
产生、结肠炎和
T
H
17 T
细胞的发展。然而
,
这个机制下不同的肠道固有层树突状细胞捕
获肠道抗原在体内还没有被探测到
。
使用最低限度的破坏性体内
成像方法表明在稳定状
态
。
小肠道杯状
细胞的功能就像是一个通道使低分子量的可溶性抗原从肠道内腔到固有
层下面的
CD103
+
LP-DCs
< br>。
优先传送的抗原对树突状细胞带有耐受的属性，暗示着杯状
细胞的能功对维持肠道免疫有关键作用
。
我们
用
荧光标记老鼠树突细胞，
在双光
子显微镜下
检查了体内肠道
LP-DCs
结合抗
原的行为
(
补充图
1
a)
。肠道腹膜腔成像和能够得到不是从完整的肠浆膜就是从
小肠支架表面通过小的纵向切口的图像
(
无花果。
1 a,b
和补充电影
1
、
上面板
)
。
准备足够稳定的允许树突细
胞在小肠组织深处运行的三维成像
(
无花果。
< br>1 c
和补
充
Movie1,<
/p>
左下方面板
)
和保障血液流动及上皮屏障
完整为了超过
4
小时的连续成
像。
在管腔内注射
10KDs
的罗丹明
葡聚糖作为抗原模型后，
通过双光子显微镜我
们
评估了的抗原分布
。上皮表面染色的葡聚糖充满了绒毛和隐窝
之间的空间
(Fig.1a,b)
。此
外
,
我们还发现圆柱右旋糖酐列直径大约
5
微米
,
穿过上皮绒毛约
20
微米长，到达固有层
,
当
从浆膜或腔的方向成像图（
1a-c,
补充图
1 b
和补充电影
1
、上面板和面板右下
)
。经上皮的右
旋糖酐列通常穿过十二指肠到回肠的贯穿整个小肠
,
并没有排斥在自固有层外的右旋糖酐而
引起上皮屏障破坏如图所示
< br>(
无花果。
1a-c)
。我们没
有检测到经上皮的右旋糖酐列在胃、结
肠、盲肠
,
或者除了上皮覆盖了盲肠的部分
(
补充图
1c--e
汉英和补充电影
2)
< br>。
共焦显微镜显
示
,
在
CD11c-YFP
标记的老鼠，右旋糖酐列经
常和含表面有连续
e
钙粘着和胞内有葡聚糖的
< br>上皮细胞结合成
黄色
荧光蛋白
(
YFP
+
)
细胞
(
无花果。
1 d
、
e
和补充电影
4,
右面板
)
。
周期性的酸性品红
(PAS)
在小肠部分的
粘蛋染色
(
无花果。
2)
用双光子显微镜观察到
右旋糖酐列被一个产生与杯状细胞
(GC)
染色模式相似的频率、
分布和尺寸识别
(Fig.2b,c)
。
此
外
,
和非细胞、
防渗不连续出现在小
肠上皮比起来，
右旋糖酐列被关联到树突细胞核
(
无花果。
2
d,
补充图
2
a
和补充电影
3)
。
确定如果右旋糖酐填充细胞实际上是
GCs,
那么部分
的小鼠小
肠从赖氨酸固定葡聚糖
/
右旋
糖酐也沾着抗体粘蛋白
2(MUC2)
和细胞角蛋白
,
这两者都是由
GC<
/p>
高表达。右旋糖酐列显示与
MUC2
和细
胞角蛋白
18
近乎完美的荧光共定位。显示上皮细
胞
GC
形态
(
图
2 e
、
f)
。因此
,
我们称这种现象
'
杯状细胞呈递抗原通道”
(GAPs)
。
解决的可能
性
,GAPs
是凋亡的
GCs,
我们为各种不同的凋亡细胞标
记染色和
原位末端标记法
(TUNEL;
补
充图。
3a-i),
包括裂解细胞
角蛋白、裂解的半胱天冬酶
3
。在所有的情况下
,
我们发现
GCs
凋
亡和
GAPs
之间没有联系。此外
,GAPs
是不同于绒毛状
M
细胞
,
因为他们用糖蛋白
2
(GP2)
标
记
不能共
定位
(
图
2
g)
。在所有无特异病原的
(SPF)
小鼠类型检查中，用双光子显微镜评估
GAPs
的频率和分布是
相似的
(
补充图
2 b d),
对回肠末端更多的
GAPs
检测没有明显趋势
(
补充
图
2
h)
。
GAPs
也明显在人类空肠切除
标本
(
图
2 h,
我
),
这表明
GAPs
是一个普遍的现象在健康
小肠。
我们检查了
C3H/HejBir
（供体菌）
、
IL-10
-/-
小鼠
对
GAPs
频率的影响
,
肠道炎症发生与
GC
缺失有关
,
无菌老鼠缺乏正常的肠道菌群。
一定量的
< br>GAPs
和
GCs
紧密相关
;
GAPs
和
GC
s
含量明显比无菌鼠多
(
补充图
2 e,g)
而少于
IL-10
-/-
小鼠
(
补充图
2 f,g)
。
先前的研究已经表明
,LP-DCs(
树突细胞
)
可以
TEDs
（经上皮的树突）从肠道上皮细胞
,
扩展到样品腔的
内容和微生物群之间。
然而
,
这些研究
使用是从来自体内腹内中取出的组织，
准备工作涉及除腔粘膜内容的前成像。
我们使用的体内成像和共焦显微镜
,
我们发现尽管
lp
dcs
用他们的树突积极的探测
上皮细胞
(
无花果。
1 c
和补充电影
1,
左下方面板
,
和补充电影
4),
但是在健康小鼠
里他们没有扩展到肠道内腔去捕获荧光抗原
(
基于超过
50
个独立活体的成
像实验检查所有区域从小肠
绒毛的尖端到隐窝的底部）
。确认我们的成像方法可以很容易地
检测
TEDs,,
我们标记
CD11c
-YFP
老鼠成像面临鼠伤寒沙门氏菌的挑战
,
这已被证明改善
TED
构成。
尽管很少的
LP-DC TEDs
在
大约
2%
的绒毛被观察到
,
但是
TEDs
没有摄取吸收腔的右
旋糖酐或在荧光共定位的基础上
beads
(
补充
Fig.4a
和补充电影
< br>5,
左上面板
)
图
1
|
稳态经上皮呈送腔的物质在鼠小肠。
a,b,
< br>从麻醉
CD11c-YFP
记者老鼠肠子注射
用
10kda
右旋糖酐
(
红色
)
与双光子显微镜活体成像从
(a)
或
(b)
浆
膜腔的表面。
光学部分增加深
度
(
显示在微米
)
在腔内显示右旋糖酐
(
星号
),
隐窝
(
黄色箭头
),
在上
皮细胞表面
(
单向箭头
)
和葡
聚糖列穿过上皮
(
白色
箭头
)
。
右旋糖酐通常被排除在
LP
作为被
CD11c-YFP1LP-DC
s(
绿色
)
低于
dapi
染色上皮细胞核
(
蓝色在<
/p>
b)
。
比例尺
,
100
微米。
c
、定时记录
lp
树突的神经
(
绿色<
/p>
,
白色箭头
)
使
重复接触一个右旋糖酐列
(
红色
)
穿过上皮
(dapi
染色细胞核
蓝色，是一种能够
与
DNA
强力结合的荧光染料
,)
。比例尺
,50
微米
;
时间标记显示
min:s
运行时间从
开始成像。
d,
呈现一个
CD11c-
YFP
+
DC(
绿色
< br>)
接触一个右旋糖酐满上皮细胞
(
红色
)
的共焦图像。面板显
示正交视
图
,
接触是由白色箭头指示。比例尺
,
5
毫米。
e
、
含有葡聚糖细胞
(
红色
)
接壤连续
e
钙粘素积极
(<
/p>
蓝色
)
表面
(<
/p>
白色箭头
)
的共焦图像。
星号表示一个光学部分的位置靠近细胞的中
心显示细胞内右旋糖酐。一个
CD11c-YFP1DC(
绿色、黄色箭头
)
定位上皮的底部附近。正交
投影
(<
/p>
底部的面板
);
红色频道离开
(
右面板
)
。比例尺
,5
毫米。
。
<
/p>
接下来
,
我们检查了对细胞管腔的
LP-DCs
来说，转运泄漏是否可作为小
肠抗原的主要
来源。
管腔内注入
5
毫克的
10KDs
右旋糖酐，
在绒毛状上皮细胞之间生产一个微弱的
'feather
葡聚糖”式的染色模式
,
与转运泄漏一致
< br>(
补充图
4 b
和补充电影
5,
右上面板
)
。
延时双光子成
像表明右旋糖酐聚集在上皮的底部
,
但有效的绒毛在收缩
,
不能与
lp
dcs
共定位，即使在大量
转
运泄漏的地区
(
补充图
4 b
和补充电影
4
、左面板
,
和补充电影
5,
右上面板
)
。此外
,
通过共焦
显微镜观查我们没有检测到运转泄漏周围被
GAPs
填满，
尽管与自由的
GCs
紧
密结合
。然
而
,
我们不能排除这种可能性
,lp
dcs
捕捉低水平转运泄漏的抗原
,
因为我们的成像方法检测的<
/p>
水平可能低于这个过程。
相比之下
,TEDs
和转运泄漏
,
< br>双光子成像提供了直接的证据表明
,
GAPs
是
lp dcs
腔的抗
原的一个来源
。
除了右旋糖酐
(
图
3),GAPs
有能力运送蛋白
质抗原
(
图
3
b)
。
尽管大多数
GAPs
在我们的成像实验期间依然可见
,
他们是一种动态现象
(
补充电影
5
、
较低的面板
)
。
此外
,
lp dcs
和
GAPs
接触的方式是变化。
在某些情况下
,DCs
保持稳定接触
,
慢慢收集抗原超过几分钟
(
图
3
一个和补充
电影
5,
左下方面板
)
而在其他情况下
,DCs
积极的伸入
< br>GAPs
，捕获抗原簇
(
图<
/p>
3
b
和补充电影
5,
右下面板
)
。
< br>我们评估了
GAPs
极限的分子量排阻
< br>
,
发现珠子从
0.02
到
1.0
微
米大小没
有进入
GAPs
间隙
(
补充图。
4
c)
。
相比之下
, GAPs
被
10KD
右旋糖酐快速的填满
(
补
充图。
4
d)
。注入葡聚糖到
CD11c-YFP1
管腔内
LP-DCs2
h
后
(
图<
/p>
3
一个和补充电影
5,
< br>左下
方面板
)
。
GAPs
也充满了更多的右旋糖酐
（补充图。
4
d);
然而
,
明显被
< br>lp dcs
捕获的是
70KDS
右旋糖酐，
2000KDS
葡聚糖的检测不到
，在我们
4 -
h
成像窗口。