躲避细胞裂解做western blot的相关问题

细胞裂解做

western blot

的相关问题

DXY

网友

mavisw

提问：

我用六孔板做细胞转染，转后要做

western

blot

检测，今天裂解转染后的

细胞时直接往六孔板的每个孔中加入了

400

微升的细胞裂解液，收集离心后未见沉淀，不知道用裂解 产物

做

western

blot

蛋白含量够不够？

DXY

网友

Pureflat

< br>回复：

六孔板中加入

400

微升 裂解液太多，这样会使你得到的蛋白浓度过低，满

足不了

Wes tern

blot

上样的需要，我第一次做这个实验时，就犯 过相同的错误，因为

Western

blot

对一

般蛋白的检测均需要上样

40

< br>微克，而上样的体积又是有限的，所以提蛋白时应尽可能的使蛋白浓度高。

因此， 我通常采用的方法是：先弃去培养液，用冰

PBS

洗

次，然后用细胞刮将细胞刮入

1.5

ml

EP

管

中，低速离心，去上清。若是六孔板的一孔细胞，在沉淀中加入

80

< br>微升裂解液即可，然后充分吹打，置

于冰上裂解

15 < /p>

min

，离心。但是，我觉得有无离心沉淀跟你加入的裂解液体积 无关，离心需用

12000

rp

m

×

5

mi n

，不知你的转速达到没有，先测测蛋白浓度再说吧。如果你的样品比较珍贵，可以考虑 用

Mini

型蛋白浓缩柱进行浓缩，

我 以前见过的最小

Mini

柱的规格是

5

ml

的，

对你不适用，

但是现在有

1

ml

的

M

ini

柱。

DXY

网友

juventus

2004

回复：

六孔板最多加

200

微升裂解液，可以用细胞刮，先低速后高速，高

速我采 用

4

度

12000

转

15

min

，其实在整个过程 中温度很重要，我习惯把所有物品提前置冰块中，在放

入

4

度冰箱，然后拿出实验，而且我在取细胞也在冰上，配裂解液临用临配，而且在冰上配，将< /p>

EP

管置

于冰中，裂解我也是把离心管置 冰中，然后塞入

4

度冰箱，

15

min

。

D XY

网友

xulees

提问：