创作背景双萤光素酶报告基因的应用,常见载体及案例简介

F-Luc

的

3

’

UTR

区域插入待验证的靶序列，

通过其翻 译抑制或

mRNA

稳定性降低，可以反映是否存在靶向互作。< /p>

Renilla

luciferas e

（简称

R-Luc

）以腔肠素（

coelenterazine

）为底物，在氧分子存

在的条件下催化

coelenterazine

氧化 生成

coelenteramide

，

此过程中发出最强波长在

465nm

左右的生物萤光。

R-Luc

通常由固定组成型启动子驱动，在报告系统中作为校正

input

误差

的内参信号。

2+

生物萤光产生反应式

一、应用方向

1.

验证

microRNA

同

mR NA

靶向互作。将待测

mRNA

的

3

’

UTR

序列插 入报告基因载体，再共

转入该

microRNA

，如果萤光素酶活性下降，则提示为其靶序列。

2.

验证

microRNA

同

lncRNA

靶向互作。将候选的

lncRNA

序列插入报告基因载体中

F-Luc

的

3

’

UTR

区域， 检测萤光素活性。

3.

启动子结构 分析。

将启动子区域序列（通常

2k

左 右）进行分段截短，

或对特定位点进行

突变，再分别构建入

luciferase

报告载体，检测其启动子活性。

4.

启动子

SNP

分析。一些基因的启动子区域存在单核苷酸多态性，可运用萤光素酶报告系

< br>统分析其相对活性。

5.

验证特定转录因子同其调控序列的作用。将该序列（通常为启动子区域）插入报告基因< /p>

载体，

同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，

可分析转录因子过表达是否提高萤光素酶

活性。

6.

可以分析信号通路是否激活。将该信号通路的下游响应原 件序列构建入报告基因载体，

在不同上游信号条件下，萤光素酶活性代表了通路的下游响 应。例如，在

GPCR

研究中，将

cA MP

response

element

（

CRE

）载入报告基因载体，构建稳定表达细胞株后，可 以用于分析

GPCR

的激活与抑制剂筛选。

又如，

将

HIF1

α

的响应原件

hypoxia-responsive

element

(HRE)

插入

luciferase

报告载体构建稳转细胞株，可以用于低氧相关 通路的研究。

二、常用萤光素酶报告基因载体

pGL3-Basic

pRL-TK