支出英文Western Blot为什么必须要用内参

Western Blot

为什么必须要用内参

要检测 一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是

Weste rn Blot

。

因为

Western

Blot

操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还 可以指示目的蛋白量的相

对变化。虽然，顺利的时候

Weste rn

Blot

做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦―― 做不出结

果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦…… 毕竟，作为一种有

活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象

1+1

那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样

知之甚少 的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的

Western

Blot

实验设计中要求有

良好的参照体系，对实验 结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就

可以查出问题所 在，

而不必抓耳挠腮怨天尤人。

良好的参照体系通常包括

分子量

Marker

（用来确定

蛋白条带对应的分子量大小）

，空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有 诱导前的对照）

，

已知

量标准产物的正 对照

；

另外还有

内参

< br>。

可是由于经费限制或者偷懒的原因，

国内的不少人做< /p>

Western

Blot

往往省略参照 ，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。

内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用

Western

Blot

比较不同条件下或者不同组织中，目的

蛋白表达量的相对多少，

前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础

。特别表达量不高时，上样

量误差就很可能影响结果的分析。所以你需要 内参。

内参

即是内部参照（

Internal

Control

）

，对于哺乳动物细胞 表达来说一般是指由

管家基因编码表达的

蛋白

< br>(Housekeeping

Proteins)

，它 们

在各组织和细胞中的表达相对恒定

，在检测蛋白的表达水平变 化

时常用它来做参照物。在

Western

Blot

实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋 白上样

电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，

还需要 进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上

样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确 性

。

在国外发表的文章中，

Western

Blot

实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国 内仍有不

少科研人员在

Western

Blot

实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种

样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的 确

定各种样品的准确蛋白浓度。如

UV

法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对

于比色法来说，操作简单， 但是容易受到平行物质的干扰，如

DNA

的干扰；且敏感度低， 要求蛋白

的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有

BCA

，

Bradford

，

Lowry

等几种方法。

BCA

法 与

Lowry

法