大学家长寄语-大学家长寄语
长链非编码
RNA MEG3
对胃癌细胞增殖的影响研究
[
摘
要
]
目的
:
探讨长链非编码
RNA MEG3
在胃癌组织及细胞系中的表达水平，
以及过表达
MEG3
对 胃癌
细胞增殖能力的影响，并探索其可能的作用机制。
方法
:
用定量
PCR
（
qRT-PCR
）技术检测胃癌组织及细胞
系中
MEG3
的表达水平； 通过转染
pCDNA-MEG3
上调
MEG3
的表 达水平，并通过
qRT-PCR
检测转染效
率。
用
MTT
和克隆形成实验检测上调
MEG3
的水平对
BGC-823
细胞和
MGC-803
细 胞的增殖能力的影响，
用
Western blot
实验 检测这两种细胞中上调
MEG3
的水平对
p53
蛋 白的表达水平的影响。
结果
:
相比正常胃
组织及细胞，在胃癌组织和细胞中
MEG3
的表达出现显著下调，
SGC7901
、
MGC-803
和
BGC-82 3
细胞中
MEG3
的表达水平分别是正常胃上皮细胞
GES-1
中的
73.6 %
、
42.0 %
和
27.1 %
（
p<0.05
）
。
BGC-823
< p>细胞
和
MGC-803
细胞中转染
p CDNA-MEG3
能显著上调
MEG3
的表达，
MEG3
的表达水平分别为对照组的
252
倍和
311
倍（
p<0.05
）
；
MTT
和克隆形成实验显示，上调
MEG3
的表达能降低
BGC-823
细胞和
MGC-803
细胞的增
殖能力。
Western blot
实验显示，转染了
pCDNA-MEG3
的
MGC-803
和
BGC-823
细胞中
p53
的表
达相较对照组中显著增加。
结论
:< /p>
胃癌组织及细胞中
MEG3
的表达下调，
且这可能通 过抑制
p53
蛋白的激活
从而促进胃癌细胞增殖，影响胃
癌的发生和发展。
[
关键字
]
< br>胃癌；长链非编码
RNA
；
MEG3
；细胞 增殖；
p53
Down-regulated long noncoding RNA MEG3
promotes cell
proliferation in gastric
cancer
[Abstract]
Objective:
To
investigate
the
expression
level
of
long
noncoding
RNA
MEG3
in
gastric cancer
tissues and cell lines, and to study the effect of
up-regulation of MEG3 expression
on
gastric
cancer
cells
proliferation
and
its
possible
mechanism.
Methods:
Quantitative
reverse-
transcription
PCR
was
performed
to
detect
the
relative
expression
of
MEG3
in
gastric
cancer cell lines and tissues. pCDNA-
MEG3 was transfected into BGC-823 cells and
MGC-803
cells to down-regulate MEG3
expression, and quantitative reverse-transcription
PCR was used to
test the transfection
efficiency. MTT and colony formation assays were
performed
to detect the
effect
of
MEG3
on
gastric
cancer
cells
proliferation.
Western
blot
assay
was
used
to
test
the
expression
level
of
p53
protein
in
MGC-803
cells
and
BGC-823
cells
transfected
with
pCDNA-MEG3 respectively, compared to
those with empty vector.
Results:
This study showed
that MEG3 was lowly
expressed both in gastric cancer samples and cell
lines compared with their
corresponding
normal
tissues
and
cell
lines.
The
expression
level
of
MEG3
in
SGC7901,
MGC-803
and
BGC-823
cells
were
73.6
%,
42.0
%
and
27.1
%
of
that
in
normal
gastric
epithelium
cell GES-1, respectively (p<0.05). Transfection of
pCDNA-MEG3 could significantly
increase
its’
expression
in
BGC-823
cells
and
MGC-803
cells
respectively,
252
and
311
folds
compared
with
control
cells
(p<0.05).
MTT
and
colony
formation
assays
indicated
that
up-regulated MEG3 could inhibit BGC-823
and MGC-803 cells proliferation. Western blot
assay
showed that the expression level
of p53 protein was significantly increased in
MGC-803 cells and
BGC-823
cells
transfected
with
pCDNA-MEG3
compared
with
those
with
empty
vector,
respectively.
Conclusion:
Down-regulated
MEG3
could
promote
gastric
cells
proliferation,
probably by
inhibiting the activation of p53, and thus affect
the development and progression of
gastric cancer.
[Keywords]
gastric cancer; long noncoding RNA; MEG3; cell proliferation; p53
胃癌是导致全球癌症相关死亡的第二大恶性肿瘤
,
近年 来其发病率呈上升趋势，
每年约
有一百万新发病例，其中
50
％的病例发生在东亚地区
（主要在中国）
[1]
。
胃癌早期临床症状
不典型，确诊的患者多以进展期
胃癌为主，常伴有淋巴结转移和腹腔内侵袭、转移，因此胃
癌患者治疗效果不佳、预后差
，
5
年生存率低于
10%
[2-4]
。因此，更好地理解胃癌的发病机
制以及分子水平的变化对发展生物
诊断标志物至关重要，
这些标志物能帮助提供新的有效的
胃癌治疗手段。
长链非编码
RNA
（
long
noncoding RNA
，
lncRNA
）是 一类在基因组转录中不参与编码
蛋白、
长度超过
200n t
的转录产物。
它具备多种生物学功能，
并在染色质修饰、
转录、
翻译、
剪接、表观遗传学调控等
[5]
多种生物进程中发挥重要作用。研究证实，
lncRNA
的变异和调
节异常能够导致包括肿瘤在内的多种疾病
[6
]
。因此确定癌症相关的
lncRNA
并研究其分子和< /p>
生物学功能对理解肿瘤分子生物学及其进展十分重要。
母系表达基因
3
（
Maternally expressed gene 3, MEG3
）是位于染色体
14q32
的肿瘤抑制
基因，其编码产物——非编码
RNA
（
noncoding RNA, ncRNA
）与肿瘤发生有关
[7,8]
。
MEG3
RNA
在许多正常组织中表达，但其在许多人类原发性肿瘤中表达缺失，包括神经胶质瘤、
< br>肝细胞肝癌、脑膜瘤和膀胱癌
[9-12]
。在人神经胶
质瘤细胞系中，
MEG3
过表达能够诱导细胞
生长停滞并
促进细胞凋亡
[9]
。
但是，
目 前对
MEG3
在胃癌中的表达水平和在胃癌致病机制中
的
生物学作用知之甚少。
本研究旨在阐明
lncRNA MEG3
在胃癌中的表达情况，
探索
MEG3
水平 变化对体外胃癌
细胞表型的影响。
本研究进一步希望为胃癌预后提供的新 标志物，
为胃癌干预治疗提供新的
靶标。
1
材料与方法
1.1
组织收集
< /p>
36
例样本来自于江苏省人民医院
2006-2008
年间被诊断为胃癌并接受手术的患者，这
些样本经过病理科严格鉴定（分期<
/p>
II,
III,
IV;
美国癌症联合会癌症分 期指南第七版）
。在手
术前所有患者均未接受过局部或全身治疗。所有样
本取下后立即液氮冷冻，在提取
RNA
之
前，
-80 °
C
环境中冻存。
本研究由 南京医科大学伦理委员会通过，
并取得所有患者
的知情同意书。
1.2
细胞系和培养条件
三种胃癌细胞系
（
SGC7901
，
MGC-803
和
BGC-823
）
以 及胃粘膜上皮正常细胞系
GES-1
购自中国科学院生物化学与细胞生物
学研究所。细胞用高糖
DMEM
、含有
10%
FBS
、
100
U/mL
青霉素以及
100
mg/mL
链霉素的培养基于
37
℃，含
5% CO
2
的潮湿恒温
培养箱中常
规培养。每
1-2
天更换新鲜培养基，当细胞 融合度达到
80%-90%
时进行传代培养。
1.3
RNA
提取和定量反转录
PCR
（
qRT-PCR
）
使用
TRIzol
试剂（购自美国的
Invitr ogen
公司）提取组织或培养的细胞中的总
RNA
。
< p>使用反转录盒
（购自大连的
Takara
公司）
将
RNA
反转录为
cDNA
。
使用
Power SYBR Green
（购自大连的
公司）做实时
PCR
分析。结果用
GAPDH
的表达量标准化。
MEG3
的
PCR
引
物
：
上
游
引
物
：
5
’
- CTGCCCATCTACACCTCACG-3
’
，
下
游
引
物
：
5
’
-CTCTCCGCCGTCTGCGCTAGGGGCT-3
’
；< /p>
GAPDH
上
游
引
物
：
5
’
-GTCAACGGATTTGGTCTGTA
TT-3
’
，下游引物：
5
’
-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3
’
。
< p>?
Δ
Δ
qRT-
PCR
和数据收集基于
ABI
7500
平台。< /p>
MEG3
相对于
GAPDH
的表达使用
2
Ct
法计算
和标准化。
1.4
质粒的构建
MEG3
序列被合成和亚克隆至
pCDNA3.1
载体（购自上海的
Invitrogen
公司）
。通过使
用
pCDNA-MEG3
转染实现
MEG3
的异常表达，
使用空的
pCDNA
载体作为对照。
使用
qPCR
检测
MEG3
的表 达水平。
1.5
胃癌细胞转染
所有用于转染的质粒载体（
pCDNA- MEG3
和空载体）经
DNA Midiprep
或
Midiprep
盒
（购自德国的
QIAGEN
公司）提取。按照使用说明书通过
Lipofectamine 2000
（购自上海的
Invitrogen
公司）将
pCDN A-MEG3
或空载体转染至六孔平板上培养的胃细胞上。
48h
后收
集细胞用于
qRT- PCR
和
Western blot
分析。
1.6
细胞增殖实验
本研究使用
MTT
试剂盒
（购自美国的
Sigma
公司）
并按其使用说明进行细胞增殖实验。
对
于克隆形成实验，在含有
10%
FBS
的六孔板中，每孔加入< /p>
500
个细胞，保存两周。集落
用甲醇固定并用
的结晶紫在
PBS
中染色
15
分钟。通过用倒置显微镜取三个随机视野
观察来判断集落形成情况。每个处理
组一式三份。
1.7
Western blot
实验
对细胞蛋白溶解物进行
10%
的
SDS-PAGE
实验，
将蛋白转到
NC
膜
（
Sigma
公司）
上，
并用特定抗体孵育。通过
放射密度测定法（
Quantity One software
，
Bio-Rad
）对放射自显影
图片进行量化。
GAPDH
作为对照。抗
p53
抗体（
1:1000
）购自
Cell Signaling Technology
公
司。
1.8
统计分析
< br>使用
SPSS
软件包（
20.0
版，
SPSS Inc.
）进行统计分析。针对重要的指标，给出相应的
95%
可信区间。
根据需要选用
Student t
检验或卡方检验进行统计学显著性分析。
P
值小于
0.05
则认为差异具有统计学意义。
2
结
果
2.1
胃癌组织、细胞中
MEG3
的表达水平
将
36
位患者的胃癌样本与癌旁正常组织的组织进行配对，使用< /p>
qRT-PCR
分别检测
MEG3
的水平， 结果用
GAPDH
标准化。结果显示癌组织中，
MEG3
的表达水平比正常组织
的平均表达水平低，为正常组织的
0.62 5
倍（
95%
可信区间：
0.39~0.86
，
P<0.01
）
（图
1A
< p>）。
本研究接下来使用
qRT-PCR
检测三种胃癌细胞系（
SGC7901
，
MGC-803
和
BGC-823
）中
MEG3
的表达水平。
结果显示，
SGC7901
细胞中
M EG3
的表达水平是正常胃上皮细胞
GES-1
中的
73.6 %
（
95%
可信区间：
0. 703~0.768
，
P<0.05
）
；
MGC-803
细胞中，
MEG3
的表达水平
是
GES-1
细胞中的
42.0 %
（
95%
可信区间：
0.255~0.287
，
P<0.05
）
；
BGC-823
细胞 中，
MEG3
的表达水平是
GES-1
细 胞中的
27.1 %
（
95%
可信区间：
0.391~0.448
，
P<0.05
）
（图
1B
）
。这
些结果证实，
的表达在胃癌组织及细胞中出现了显著的表达下调。
A.
定量
PCR
检测
36
对胃癌组织
/
癌旁正常组织中
MEG3
的相对表达水平（倍数关系）
。按从大到小的
顺序排列，其中蓝色表示
MEG3
在胃癌组织中表达水平高于癌旁正常组织水 平，共
5
组；红色表示
MEG3
在胃癌组
织中表达水平低于癌旁正常组织水平，共
31
组。
P<0.01
B.<
/p>
定量反转录
PCR
检测三种胃癌细胞系（
SGC79 01
，
MGC-803
和
BGC-823
）以及正常胃上皮细胞系
GES-1
中
MEG3< /p>
的相对表达水平（相对于
GES-1
中
MEG3
的表达水平）
。
（
*
，
P<0.05
）
图
1
胃 癌组织、细胞系中
MEG3
的表达水平
Figure 1 Expression level of MEG3 in
gastric cancer tissue and cell lines
2.2
体外实验外源性上调
MEG3
的表达对胃癌细胞增殖的影响
MEG3
在胃癌样本细胞中的显著低表达促使本研究作者探索
MEG3
在肿瘤发生中可能< /p>
的生物学重要性。为了调控胃癌细胞中
MEG3
的水平，本 研究将
pCDNA-MEG3
载体转染
至
BGC-823
和
MGC-803
细胞中，
以空载 体作为对照。
转染
48h
后进行
qRT-PCR< /p>
分析
MEG3
的表达。
实验结果显示，
与各自对照细胞相比，
BGC-823
和
MGC-80 3
细胞中
MEG3
的表达
分别增加
252
倍（
95%
可信区间：
214~2 90
，
P<0.05
）和
311
倍 （
95%
可信区间：
282~340
，
< p>P<0.05
）
（
图
2A
< p>）。
另外，
MTT
实验显示，
转染了
pCDNA-MEG3
载体的
BGC-823
和
MGC-803
细胞数量于
24
、< /p>
48
、
72
、
96
小 时后均显著高于各自的对照组（
48
小时
P<0.05
< p>，72
、
96
小
时<
/p>
P<0.01
）
，提示细胞增殖受到明显抑制（图
2 B
，
2C
）
。类似地，克隆形成实验同样显示，< /p>
随着
BGC-823
和
MGC-803
细胞中
MEG3
的过表达，视野观察的集落形成数目减少，克隆
源性细胞的存活明显减少（图
2D
，
2E
）
。
A.
转染了
pCDNA-MEG3
的
BGC-823
和
MGC-803
细胞中
MEG3
的过表达效率。纵轴过表达效率数值
为与各自空白对照对比的
相对值。两者皆有
P<0.01