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浙江大学肿瘤研究所流式细胞分选服务预约注意事项
一、服务项目
1.
无菌细胞分选
:
各种细胞系、原代细胞、肿瘤组织单细胞悬液、骨髓等
2.
特殊细胞分选或其他项目：请联系管理员葛维挺（
geweiting@
）
。
3.
< p>本仪器以分选为主，分析与分选收费标准相同，建议事先使用其它流式细胞仪确认细胞阳性染色比< p>
例。
二、特别注意
1.
安全性问题：由于在分选过程中，样本可能通过液滴震荡产生气溶胶，所以不接受会传播人类病原
菌的生物有害样本，也不接受含放射性生物样品。
2.
应知道细胞的大小与形态，以便选择分选用喷嘴。 所分选细胞的直径最好小于喷嘴直径的
1/5
，至少
小于
1/3
。细胞的形态也会影响了分选的结果，理论上越接近于球形的细胞，分选过 程中的剪切力对
细胞造成的伤害就越小。形态特殊的细胞应选择较大的喷嘴，以减轻分选
过程对细胞造成的伤害。
各种细胞的建议浓度和所用喷嘴如下表。
Table 1
细胞种类和浓度、喷嘴的选择
细胞种类
Lymphocytes,
thymocytes or splenocytes
(
直径
8-
12 μm)
Activated lymphocytes, smaller cell
lines (
直径
12-
20 μm)
Large adherent cell line
(
直径
>20 μm)
浓度
8 - 12 ×
10
6
/ml
7- 9
×
10
6
/ml
5 - 8 ×
10
6
/ml
喷嘴
85
μm
85
μm
100
μm
3.
荧光染料的选择：如选择
1
到
4
个荧光标记，一般按如下顺序选择，
FITC
、
PE
、
APC
和
Per CP
。
三、样本制备
1.
样本制备基本流程：
获取细胞悬液→荧光抗体染色→调整细胞浓度（参考
Table 1
）→避光置冰上运至分选室→移入带过
滤头的流式管→上机检测并设定分选条
件→试分选并上机检测纯度→分选细胞。
2.
分选所用的细胞染色方法与分析所用方法基本相同，但需要注意以下几点：
a
）
保证样本的无菌状态，因为分选得到的细胞还要继续培养
b
）
不同使用固定剂固定细胞，因为活细胞经固定剂处理后即死亡
c
）
保证上机样品为单细胞悬液（我们提供带过滤头流式管
(Falcon Cat# 352235
）
）
d
）
准备充足的细胞，详见
FAQ3
e
）
分选缓冲液使用含
2%FBS
或
BSA
的
PBS
，普通培养基中的酚红可能会干扰分选
f
）
如细胞分选后需再次培养，请准备 含血清的收集管，在分选前交操作员。建议在
15ml
离心管中
< br>加入
1-2ml
血清及其它必需组分，保证分选完毕时血清浓度大于
5%
1
g
）
如要分选
GFP< /p>
等转染的样品，请提供未经转染的相同细胞为阴性对照
h
）
如要做多重荧光染色标本的分选，请提供各种单一荧光染色的标本
i
）
如要去除死细胞，在不影响后续实 验前提下，可以加入
7-AAD
或是
PI
j
）
快速简便的样本处理有利于分选： 处理好的样本尽快上机，分选好的细胞尽快下一步实验，如
果要分选多个样本，建议一次
处理一个，估计可能的上机时间后，再处理第二个样本
四
.
常见问题
Q1.
上机样品需要溶在何种溶液中？是否可以就直接放在原本培养的培养基中？
Ans
:
建议不要放培养基中，因为
Phenol Red
可能会影响分选的结果，可先尝试使用含
2%FBS
或< /p>
BSA
的
PBS
作为分选缓冲液。如要求更 好的细胞存活率，按分选细胞的不同，选择不同的分选缓冲液。
1.
淋巴细胞
（
HBS S
配方中的阳离子可增进细胞的生存力。如果这些细胞并非易于群集细胞，可以选用
没有
EDTA
的缓冲液）
。
a)
1 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0) and 0.5% - 2% BSA in 1×
PBS (without Ca
2+
and Mg2+)
b)
1×
HBSS (without phenol red) with 1% BSA
c)
0.5% - 2% BSA in PBS(without Ca
2+
and
Mg
2+
)
2.
< /p>
贴壁细胞
（以
Trypsin
处理后去准备单细胞悬 浮液时，待细胞变圆
(
切记不可过度作用
)
，以适 量含
5%
血清培养液收取细胞，并均匀地打散细胞悬浮液。离心后，用分
选缓冲液调整细胞浓度。如果需要
的话可以提高
EDTA
的浓度
(
至
5mM)
以避免细胞重新黏聚）
。
a
）
5 mM EDTA, 25mM Hepes (pH7.0) and 0.5% - 2% BSA in 1×
PBS (without Ca
2+
and Mg
2+
)
b
）
0.5-2% BSA in PBS(without Ca
2+
and
Mg
2+
)
3.
< /p>
含有高比例死细胞的样本（这些配方可减少因死细胞释放出来的
DNA
所造成的细胞黏聚现象。）
5mM
MgCl
2
, 1 mM EDTA, 25mM Hepes
(pH7.0), 25-50
μg/mL DNAase I and 0.5%
- 2% BSA in 1×
PBS
(without Ca
2+
and
Mg
2+
)
4.
建议询问有经验者（使用相同细胞进行过分选）的分选缓冲液配方
Q2.
如果细胞要再培养，会污染吗？
Ans
:
分选所用的所有溶液都经高温高压灭菌，流式 分选仪管路使用
70%
乙醇定期清洗，仪器所在房间在
每
次分选前紫外灭菌，最后在细胞培养基中加入抗生素，可将污染机率降至很低。
Q3.
如果我想在分选后拿到
1×
10
6
的细胞我应该一开始准备多少细胞
去做分选？
Ans
:
假设你要的细胞 只占总数的
10%
，则你所需准备的细胞数如下公式
: 1×
10
6
=10%×
50%
回收率
×
20×
10
6
(
起始细胞数
)
，所以你需要准备
2×
10
7
细胞。高速分选、纯度模式
(purity vs. yield mode)
、部分细胞
2