-
ISS
N
1007
2
7626
C
N
< br>
11
2
3870
Π
Q
中国生物化学与分子生物学报
< br>Chinese
Journal
of
Biochemist ry
and
M
olecular
Biology< /p>
2001
年
6
月
17
(
3
)<
/p>
:356
～
360
Nmi
及其变异体在大肠杆菌中表达
、
抗体制备及其细 胞分布
莫晓宁
,
孙荣 华
,
钟英成
,
张颖妹
,
陈英玉
,
马大龙
(<
/p>
北京大学医学部免疫学系
,
北京
100083
)
3
摘要
为了检测细胞内源性
Nmi
和变异体
Nmi
2
s<
/p>
的表达
、
亚细胞分布以及可能形成的信号转导蛋
< p>白复合物
,
成功构建并表达了异源
Nmi
和
Nmi
2
s
1
获得纯化异源蛋白
,
用以制备兔源抗
Nmi
(
Nmi
2
s
)
多克隆抗体
.
Western
印迹在多种细胞
株
H
L
2
60
,
K
562
,293T
细胞中检测
到
Nmi
(
Nmi
2
s
)
高表达
.
在不
同的细胞系中
,Nmi
表现为不同的蛋白复合物迁移带
;Nmi
(
Nmi
2
s
)
在胞浆和胞核均存在
,
而核内荧
光更强
.
Nmi
(
Nmi
2
s
)
通过与多种蛋白相互作用行使其生物学功能
,
在不
同细胞中可能与不同的蛋白
相互作用
,
发挥不同的功能
.
关键词
Nmi
,
变异体
,
原核表达
,
多克隆抗体
,
蛋白印迹
中图分类号
Q291
,Q786
Expression
of
R
ecombinant
Nmi
,
Preparatio n
of
Polyclonal
Antibody
< br>and
Their
E
ndogenous
E xpression
and
Subcellular
Locali zation
M
O
X
iao
2
ning
,
3
S
UN
R
ong
2
< br>hua
,
ZH
ONG
Y
in g
2
cheng
,
ZH
ANG
Y
ing
2
mei
,
CHE
N
Y
ing
2
yu
,M
A
Da
< p>2
long
(
Depar
tment
o
f
Immunology
,
Peking
University
H
e alth
Science
Center
,
Beijing
100083
,
China
)
3
A
bstract
T
o
dete ct
endogenously
expressed
Nmi
(
Nmi
2
s
)
and
possible
signa ling
com
plex
in
mammalian
cell
lines
and
to
make
certain
their
subcellula r
location
,purified
recombinant
Nmi
and
its
is
ofor m
were
obtained
in
E
.
coli
,which
w ere
used
to
prepare
polycl onal
antibody.
Nmi
(
< br>Nmi
2
s
)
< br>were
highly
expressed
in
< p>HL
2
60
,
K
562
and
293T
cell
lines
by
Western
blot.
< p>Nmi
(
Nmi
2
s
)
could
form
large
protein
com
plexes
exhibiting
as
different
mi
2
grating
band
in
separate
cell
lines.
Nmi
(
Nmi
2
s
)
distributed
both
in
cytoplasm
and
nucleus
,but
m
ore
condensed
in
nucleus.
It
could
be
concluded
that
Nmi
(<
/p>
Nmi
2
s
)<
/p>
executed
its
function
by
ass
ociating
with
other
proteins.
It
might
in terfere
with
different
signaling
pathways
in
various
cell< /p>
lines
by
forming
certain
protein
com
plex.
K
ey
w
ords
Nmi
,
is
oform
,
expres sion
,
polyclonal
antibody
,
Western
blot
Myc
家族成员因其在细胞的增殖
、
分化和肿瘤
细胞的转化过程中起着重要的作用而引起人们广泛
[1
～
3
]
的兴趣
.
1996
年
Bao
等
人用酵母双杂交系统研
究与
Myc
相互
作用的蛋白时发现了一个新基因
,
命
[
4
]
名为
Nmi
.
Nmi
编码的蛋白质可与
Myc
家族中的
[5
,6
]
N
2
Myc
,C
2<
/p>
Myc
,Max
和
F
os
相互作用
.
1997
< p>年
,
我
室在研究细胞凋亡
的过程中发现去细胞因子的
TF
2
1<
/p>
细胞高表达
Nmi
,
同时还发现在此过程中有
Nmi
[7
]
的新的变异体存在
.
为了进一步研究
Nmi
及其变
异体的生物学功能
,
我们对
Nmi
及其变异体
进行大
肠杆菌系统的表达
,
制备抗
Nmi
的多克隆抗体
,
检测
细胞中内源性
Nmi
蛋白的表
达
.
证明
Nmi
可在多种
细胞系中表达
,
并与其它分
子形成大的蛋白复合物
,
行使生物学功能
.
1
材料与方法
1
1
1
材料
< p>
Nmi
及其变异体测序用质粒由本室王玉刚博
士
构建
;
pMTY
4
< p>融
合
蛋
白
表
达
质
粒
由
本
室
构
< p>建
;
P
op2136
(
CI857
,endA
,thi
,h sdR
)
为
C600
< br>衍生菌
,
编码
温度敏感的
λ
阻遏蛋白
,
由
Raibaud
博士馈赠
;
所用
工具酶购自
GI
BC
O
公司
;
蛋白纯化用
DE
AE
2
Sepha
2
rose
FF
购自
< br>Pharmacia
公司
;
碱性
磷酸酶标记羊抗兔
二抗购自
Sigma
公司
;
碱性磷酸酶显色试剂购自
Pro
2
收稿日期
:2000
2
09
2
22
,
接受日期
:2000
2
11
2
16
3
联系人
T
el
:
< p>(
010
)
620911
49
,
Fax
:
(
010
)
6209114
9
莫晓宁
,
女
,1969
年生
,
硕士
Received
:September
22
,2000
;Accepted
:N
ovember
16
,2000
3
C
orrespond ing
author
T
el< /p>
:
(
010
)
62091149
,Fax
:
(
010
)
62091149
? 1995-2003 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co.,
Ltd. All rights reserved.
第
3
期
莫晓宁等
:Nmi
及其变异体在大肠杆菌中表达
、
抗体制备及其细胞分布
3
5
7
mega
公司
;
蛋白酶抑制剂购自
Bo
ehringer
Mannheim
公司
.
1
1
2
引物
根据
Nmi
的编码区序列合成
PCR
引物
:<
/p>
上游引
物从
起
始
密
码
子
开
始
,
序
列
为
:
5
< br>′
2
ATGG
AAG
CT
2
G
AT
AAAG
ATG
AC
2
3
′
;
下游引物为测序载体上
M13
< br>逆
向引物
,
序列为
:5
′
2
C
AGG< /p>
AAAC
AG
CT
ATG
AC
2
3
′
.
1
1
3
细胞株
H
L
2
60
,
Jurkat
,
K
562
细
胞
系
在
10
%
FCS
,
RP
< br>2
MI1640
,5
%C
O
2
条件下培养
;293T
由村田正博士馈
赠
,
在
10
%FCS
,DME
M
,5
%C
O
2
条件下培养
< br>.
1
1
4
Nmi
及其变异体
PCR
扩增以及原核融合蛋白
过程同上
.
1
1
9
免 疫荧光检测
Jurkat
细胞中
Nmi
(
2
s)
分布
6
收集
1
×
10
Jurkat
细胞
,
经
1
%
多聚甲醛固
定
.
甲醇处理后
,
用
NBS
封闭过夜
,
然后加制备的多抗
(
一抗
)
,4
℃
温育
30
min
,
冷
P
BS
洗
2
遍
,
再加
FITC
标记的二抗
.
在激光扫描共聚焦显微镜下观察结果
.
2
结果
2
1
1
Nmi
及
Nmi
2
s
原核表
达质粒的构建
表达质粒构建
用
M1
3
逆向引物和
Nmi
的
5
′
引物
,
分
别从
p
GE
M
2
T
2
Nmi
,p
GE
M
2
T
2
Nmi
2
s
测序质粒
上扩增
Nmi
和
Nmi
2
s
.
PCR
产物经纯化后用
K
lenow
和
Sal
Ⅰ
处
理
;
与
Stu
Ⅰ
和
Xho
Ⅰ
处理后的
pMTY<
/p>
4
大片段连接
.
连接产物
转化感受态大肠杆菌
P
op2136.
通过蛋白
表
达筛选和酶切鉴定
,
分别得到
Nmi
和
Nmi
2<
/p>
s
的表达
克隆
.
1
1
5
Nmi
及其变异体重组蛋白的表达和纯化
将细菌株扩增培养后
,42
℃
诱导表达
3
h
,
离心
收集菌体
,
超声裂解
,<
/p>
离心收集沉淀得到包涵体
.
包
涵体经洗涤
、
变性
、
复性
< p>、凝血酶切
、
DE
AE
2
Sepharose
FF
柱层析
、
制备电泳等纯化步骤后得到纯度在
95
%
以上的蛋白样品
.
1
1
6
抗
Nmi
蛋白的多抗制备及纯化
从第一个密 码子扩增全长
Nmi
或
Nmi
2
s
的
PCR
产物的大小与预期结果一致
(
Nmi
全
长
921
bp
,
Nmi
2
s
全长
759
bp
,128
bp
为测序载体上的序列
)
,
如
Fig.
1
构建表达质粒
.
挑选体重约
1
1
5
kg
健康大耳白雄兔进行免疫
.
两次加强免疫后心脏取血
,
分离血
清
,
经过两次
33
%< /p>
硫酸铵沉淀
,
再经
Protein
2
G
亲和柱纯化后<
/p>
,
得到
纯度
><
/p>
98
%
的抗体
.
< br>1
1
7
Western
印迹检测原核表达的
Nmi
< br>及
Nmi
2
s
< br>
用纯化所得的原核表达的
Nmi
及<
/p>
Nmi
2
s
进行
12.
5
%
S
DS
2
PAGE
分析
,W
estern
印迹的方法参考文
献
[1
1
].
1
1
8
Western
印迹检测培养细胞系内源性表
达的
Nmi(
Nmi
2
s)
6
分别收集
1
×
10
H
L
< p>2
60
,
K
562
,Jurkat
,293T
细
胞
,
用
100
μ
l
细
胞
裂
解
液
(
10
mm
ol
< p>Π
L
Tris
2
< br>HCl
,
pH7
1
4
,150
mm
ol
Π
L
NaCl
,1
%
NP
< br>2
40
,0.
5
%
去氧胆酸
钠
,
蛋白酶抑制剂<
/p>
)
裂解
.
细胞裂
解液上清分别进行
还原及非还原电泳
.
还原电泳同上
.
非还原电泳聚丙
烯酰胺
浓度为
6
%
(
电泳系统
中不含
S
DS
,
样品缓冲
液中无
β
2
巯基乙醇
)
在低温低电压下电泳
,
蛋白杂交
Fig.
1
C
onstruction
of
Nmi
(
2
s
)
fusion
expression
vector
2
1
2
Nmi
及
Nmi
2
s
表达克隆的质粒酶切鉴定
Nmi<
/p>
及
Nmi
2
s<
/p>
表达克隆的质粒与预计的大小一
致
.
酶切图谱正确
,
见
Fig.
2.
2
1
3<
/p>
Nmi
及
Nm
i
2
s
的重组蛋白的
< br>SDS
2
PAGE
Nmi
,
Nmi
2
s
编码天然蛋白的分子量分别为
33
kD
,30
kD.
融合表达克隆编码<
/p>
MS2
聚合酶片段
(
分
子量为
11
kD
)
、
凝血酶酶切接头和下游
Nmi
(
Nmi
2
s
)
的融合蛋白用凝血酶切割接头的特异位点
,
将融合
蛋白切为
MS2
和
Nmi
(
Nmi
< br>2
s
)
天然分子
.
Nmi
及
Nmi
2
s
表达克隆均能表达预期大小的融合蛋白
,
分子量
分别约为
4
4
kD
,40
kD.
经凝血酶切后分别产
生与天
然蛋白大小一致的蛋白带
.
如<
/p>
Fig.
3.
? 1995-2003
Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All
rights reserved.