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DOI:10.16438/j.0513-4870.2013.03.002
药学学报
Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (3): 417
?
422
?
417
?
iRGD
修饰的阿霉素主动靶向脂质体的细胞 毒与抗肿瘤效果评价
赵
波
1
,
范俣辰
1
,
王学清
1*
,
代文兵
1
,
张
强
1*
,
王杏林
2
(1.
北京大学药学院药剂学系
,
北京
100191; 2.
天津药物研究院释药技术与药代动力学国家重点实验室
,
天津
300193)
摘要
:
本研究拟制备
iRGD
修饰的阿霉素主动靶向脂质体
,
对其理化性质、细胞毒和抗肿瘤效果进行评价
,
并与载
阿霉素的被动靶向脂质体、
RGD
修饰的阿霉素主动靶向脂质体进行比较。首先将 同时具有肿瘤细胞靶向
和细胞穿透功能的
iRGD
肽以及
RGD
肽连接到
DSPE-PEG-NHS
上得到
iRGD
及
RGD
修饰的导向化合物
DSPE-PEG-iRGD
和
DSPE-PEG-RGD;
然后采用硫酸铵梯度法制备
iRGD
、
RGD
< p>修饰的主动靶向脂质体和被动靶
向脂质体
;
最后采用动态光散射测定不同脂质体的粒径
,
柱层析法测定其包封率
, SRB
法评价其细胞毒性
,
荷
B16<
/p>
黑色素瘤的
C57BL/6
小鼠进行抑瘤效果的评价。
结果表明
,
不同脂质体粒径在
90
～
100 nm,
包封率达到
95%
以上
,
制备重现性好
;
在细胞毒性方面
, iRGD< /p>
修饰的脂质体与被动靶向脂质体、
RGD
修饰的脂质体均无显著性< /p>
差异
;
在抗肿瘤效果方面
, iRGD< /p>
修饰的脂质体与
RGD
修饰的脂质体对荷
B16
黑色素瘤的
C57BL/6
小鼠的抑制
肿瘤生
长效果显著强于被动靶向脂质体
,
但二者的抑瘤效果没有显著性差异。综上
, iRGD
修饰的阿霉素主动靶
向脂质体
,
作为一种药物输送系统
,
在肿瘤治疗方面有一定的应用前景。
关键词
: iRGD;
穿膜肽
;
肿瘤靶向
;
细胞毒
;
抗肿瘤效果
中图分类号
: R943
文献标识码
:
A
文章编号
: 0513-4870 (2013) 03-0417-06
Cellular toxicity and anti-tumor
efficacy of iRGD modified
doxorubixin loaded sterically
stabilized liposomes
ZHAO
Bo
1
, FAN Yu-
chen
1
, WANG Xue-
qing
1*
, DAI Wen-
bing
1
, ZHANG
Qiang
1*
, WANG Xing-
lin
2
(
1. Department of Pharmaceutics, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, Beijing 100191, China;
2. State Key Laboratory of Drug
Delivery Technology and Pharmacokinetics, Tianjin
Institute of Pharmaceutical
Research, Tianjin 300193,
China
)
?
Abstract
: iRGD-modified sterically stabilized liposomes loaded doxorubicin (iRGD-SSL-DOX) were
prepared and
their cellular toxicity and anti-tumor efficacy
were evaluated, comparing to doxorubixin loaded
sterically stabilized liposomes (SSL-
DOX) and RGD modified doxorubixin loaded
sterically stabilized liposomes
(RGD-
SSL-DOX).
The iRGD peptide, with both tumor targeting and cell penetrating functions, was conjugated
to DSPE-PEG-
NHS and DSPE-PEG-iRGD was obtained. DSPE-PEG-RGD
was gained in the same way.
iRGD-SSL-
DOX, RGD-SSL-DOX and SSL-DOX were prepared by
ammonium sulfate gradient method.
The
size and zeta potential of
the liposomes were characterized by dynamic laser
light scattering. The cellular
toxicity study was done on B16 melanoma
cell line and the anti-tumor efficacy study was
carried on B16 cell line
bearing
C57BL/6 mice.
The results showed that the particle sizes of liposomes were all around 90
?
100 nm.
DOX entrapment efficiency was above
95%. The formulations were with good preparation
reproducibility.
iRGD-SSL-DOX showed
no significant difference in B16 cellular toxicity
with SSL-DOX and RGD-SSL-DOX,
but the
anti-tumor efficacy on B16 melanoma bearing
C57BL/6 mice was significantly better than that of
收稿日期
: 2012-10-10;
修回日期
: 2012-11-27.
基金项目
:
国家自然科学基金资助项目
(81130059);
国家重点基础研究发展计划
(973
计划
)
资助项目
(2012CB724002).
*
通讯作者
Tel / Fax: 86-10-82801584, E-mail: wangxq@
Tel /
Fax: 86-10-82802791, E-mail: zqdodo@
?
418
?
药学学报
Acta Pharmaceutica Sinica 2013, 48 (3): 417
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SSL-DOX, similar as that of
RGD-SSL-DOX.
Therefore, iRGD modified liposomes loaded DOX would be a
promising drug delivery system for
tumor therapy.
Key words
: iRGD; cell-penetrating peptide; tumor targeting; cellular toxicity; anti-tumor efficacy
化学疗法是临床上治疗肿瘤的主要途径之一。
一
直以来
,
普通抗肿瘤的化疗药物在肿瘤部位的低浓
度和严重毒副作用是其临床
应用受限的首要问题
,
因此
,
抗肿瘤药物的靶向输送成为科学研究的焦点。
作为配体
,
多肽在主动靶向药物输送系统中的
应用受到了广泛的关注。
根据其效应的不同大致分为
3<
/p>
类
:
①
单纯靶向肽
,
仅仅靶向到某一器官或特定组
织
,
没有细胞穿透的功能
;
②
细胞穿膜肽
,
本身没有
靶向功能
,
但通过形成孔隙或 者与特定受体的细胞
表面接触时能够引起受体介导的内吞产生细胞膜穿
< br>透效应
;
③
靶向穿膜肽
,
本身具有靶向效应
,
< p>并且到
达特定部位后还能通过细胞表面受体介导细胞膜穿
透
效应递送药物
[1]
。
iRGD
肽属于上述第
3
类多肽
,
其
序列为
CRGDRGPDC,
其中的
RGD
序列具有整合素
靶向的功能
,
能够靶向到整合素表达较高的肿瘤部
位
,
而经过肿瘤附近特定酶切割之后的
R
残基片段
,
则能够与肿瘤细胞表面的
NRP-1
受体相互作用
,
介
导发生细胞膜穿透效应
[2]<
/p>
。
因此
, iRGD
这种多功能的
多肽正在受到广泛的关注和研究。
隐形脂质体
(SSL)
是靶向给药系统的一种药物< /p>
载体。
该载体能够避免网状内皮系统的吞噬
,
< p>显著延
长药物在体内的循环时间
[3]
,
同时借助肿瘤组织的透
过性增强及滞留
(EPR)
效应
被动靶向于肿瘤组织
,
使药物在肿瘤组织保持较高浓度。近来的研究发现
,
< br>提高肿瘤细胞内的药物浓度才是抗癌药物疗效的关
键
,
而隐形脂质体的被动靶向作用并不能完全满足
这一要求。因此
,
选择合适的肿瘤细胞靶点
,
设计具
有主
动靶向作用的配体修饰的隐形脂质体成为了新
的研究热点。
< p>
本研究选取同时具有整合素受体靶向作用和细
胞穿膜作用的多肽
作为配体
,
以阿霉素为模型
药物
,
制备具有主动靶向和穿膜作用的隐形脂质体
,
并对其进行细胞毒性和抗肿瘤效果评价
,
同时与被
动靶向脂质体、
RGD
修饰的主动靶向脂质体进行比
较
,
为进一步研究提供一定的依据。
[4]
公司
; DSPE-PEG-NHS (PEG
M
w
2 000),
日本
NOF
油
脂公司
; DSPE-PEG (PEG
M
w
2
000),
日本
NOF
油脂
公司
;
阿霉素
(doxorubicin, DOX),
浙江海正药业公
司
;
多肽
iRGD (
序列
CRGDRGPDC),
上海吉尔生化
;
多肽
RGD (
序列
RGD),
上海吉尔生化
;
磺基罗丹明
B (SRB),
美国
Sigma
公司
; Nano ZS
激光粒度测定仪
,
英国
Malvern Instruments
公司
; MULTISKAN FC
酶标
仪
,
美国
Thermo
公司。
细胞株及动物
鼠源黑色素瘤细胞株
B16,
购于
北京协和细胞库
;
雄性
C57BL/6
小鼠
(SPF
级
, 6
～
8
周龄
),
购于北京大学医学部实验动物部并由该部门
饲养
,
合格证号
: SYXK (
京
) 2011-00 39
。所有实验均
按照国际动物实验的指导标准进行。
导向化合物的合成
精密称取
DSPE-PEG- NHS
和
iRGD/RGD (DSPE-PEG- NHS
∶
iRGD/RGD =
2
∶
1,
mol/mol)
分别溶于新鲜蒸馏的无水无氨的
DMF
中。
在搅
拌状态下将
DSPE-PEG-NHS
溶液滴加至
iRGD/
RGD
溶液中
(iRGD/RGD
的终浓度分别为
3 mg·mL
?
1
和
1 mg·mL
?
1
),
同时加入适量三乙胺
(
约
8 < /p>
μ
L·mL
?
1
)
,
室温避光搅拌
, 2
天后终止反应。反应液置透析袋
(
M
w
3 500)
中
,
于去离子水中透析
48 h
后冷冻干燥
,
?
20
℃
保存。反应过程中薄层色谱法监测反应进度
,
终产物进行
MOLDI-TOF MS
分析
[5]
。
空白脂质体的制备
采用薄膜分散法制 备
3
种
空白脂质体
,
即被动靶向空白脂质体
(SSL), RGD
修饰的主动靶向空白脂质体
(RGD-SSL),
iRGD
修饰
的主动靶向空白脂质体
(iRGD-SSL)
。按处方量
(
表
1)
精密称取各种脂材于
100 mL
茄形瓶中
,
加氯仿
15
mL
溶解
, 37
℃
减压旋转蒸发
1 h
成均匀的透明
薄膜。精密吸取
123 mmol·L
?
1
硫酸铵溶液
1 mL
加入
到茄形瓶中
,
振荡涡旋使脂膜完全脱落
, 37
℃
水浴
超声
20 min,
得到澄清透明具淡蓝色乳光的脂质 体
溶液。将制得的空白脂质体过
Sephadex G50
柱
,
用
PBS (pH
7.4)
洗脱
,
收集脂质体部分
,
得到外水相为
PBS
、内水相为硫酸铵溶液的空白脂质体
[6]
。
载药脂质体的制备
采用硫酸铵梯度法 对
3
种
空白脂质体进行阿霉素的装载。
配 制
5 mg·mL
?
1
的阿
霉素储备液
,
以药脂比
1
< br>∶
10
将储备液分别加入到
3
种空白脂质体中
, 37
℃
摇床孵育
15 min
。
药物装载完
毕后用
Sephadex G50
柱去除未包载药物
,
收集红色
材料与方法
药品、试剂和仪器
卵磷脂
(EPC),
德国
Lipoid
GmbH
公司
;
胆固醇
(Chol),
美国
Pharmacia Biotech
赵
波等
: iRGD
修饰的阿霉素主动靶向脂质体的细胞毒与抗肿瘤效果评价
?
419
?
脂质体部分得
3
种载药脂质体
,
即被动靶向脂质体
(SSL-DOX),
RGD
修饰的主动靶向脂质体
(RGD-SSL-
DOX), iRGD
修饰的主动靶向脂质体
(iRGD-SSL-
DOX)
。
3
种 载药脂质体于
4
℃
保存备用。
中加入预冷的
50%
三氯醋酸
1 00
μ
L
于
4
℃
固定
1 h
。
倒出固定液
,
每孔用去离子水洗
5
遍
,
甩干
,
空气干
燥。
每孔加入
0.4% SRB
溶液
(
以
1%
乙酸配制
) 100
μ
L,
在室温放置
15min, 1%
醋酸洗去未结合蛋白质的
SRB,
Table 1
Formulations of sterically stabilized liposomes (SSL),
RGD-SSL and iRGD-SSL
Composition SSL
RGD-SSL
iRGD-SSL
Chol(mg)
DSPE-PEG(mg)
DSPE-PEG-
iRGD(mg)
4.1
6
0
4.1
4.5
0
4.1
5.91
0.09
空气干燥。每孔加入
10 mmol·L
?
1
Tris
碱液
100
μ
L
振荡溶解
30 min
。
于
MULTISKAN FC
酶标仪测定各
孔吸光度
(
A
),
测定波长为
540 nm
。根据各孔
A
值
计算药物对细胞的增殖抑制率
,
并推算出
50%
抑制浓
EPC(mg) 15.9
15.9
15.9
度
(IC
50
)
。抑制率
(%)
=
(
溶液对照孔
A
值
?
给药孔
A
值
)
/
溶液对照孔
A
值
×
100%
。
DSPE-
PEG-RGD(mg) 0
1.5
0
抑瘤效果评价
使用荷瘤
C57BL/6
小鼠模型评
价脂质体对
B16
实体瘤的治疗作用。
B16
细胞用
10% FBS
的
1640
培养基培养。 临用前细胞用胰酶消
化
, 1 000 r·min
?
1
离心
5 min,
弃上清液
,
下沉细胞重
悬于
无血清
1640
培养基
,
调整细胞数至
1×10
6
/mL,
将
细胞悬液按
200
μ
L/
只接种于小鼠右侧大腿皮下。接
种结束后的第
7
天肿瘤大小平均值达到
50 mm
3
。将
荷瘤小鼠随机分为
5
组
,
分别尾静脉注射生理盐水
(Sal)
、
游离阿霉素
(DOX)< /p>
、
iRGD
修饰的脂质体、
RGD
< br>修饰的脂质体和被动靶向脂质体。给予阿霉素的剂
量均为
2 mg·kg
?
1
(
除生理盐水组外
),
每两天给药
1
次
,
共
4
次。
每组
7
～
8
只。
从第
8
天开始
,
隔天用游
标卡尺测量肿瘤长径
(
l
)
和短径
(
r
),
计算肿瘤体积
(
V
)
。
第
14
天时处死所有小鼠
,
剖取肿瘤并称重照相。
肿瘤体积计算公式
:
V
=
(
l
×
r
2
)
/
2
。
统计方法
细胞毒性评价利用
SPSS for windows
16.0
软件包进行统计分析。动物肿瘤抑制效果评价
利用
Microsoft Office Excel
软 件进行统计分析。
两个
总体均数差异采用
Student ’s-test
进行检验
,
单侧检
验
P
< 0.05
时认为有显著性差异。
脂质体粒径的测定
脂质体的平均粒径、
多分散
系数采用激光粒度测定仪进行测定。
多分散系数表示
粒子大小分散的均匀度。激光束波长设定为
633 nm,
入射与散射光束夹角为
90
度。
脂质体包封率的测定
精确吸取脂质体
0.5 mL
两份。
一份直接置于量瓶中
;
另一份过
Sephadex G50
柱
,
收集脂质体部分于量瓶中。分别加入
1% Triton
溶液
0.2 mL
破坏脂质体
,
并用
PBS
定 容。采用可见
分光光度计测定两份样品中阿霉素的总浓度
(
测定
波长为
485 nm),
计算阿霉素脂质体包封率。包封率
计算公式
:
包封率
(%)
=
(
过柱后收集脂质 体的阿霉
素浓度
/
未过柱脂质体的阿霉素浓度
)
×100%
。
配体密度筛选
按上述脂质体制备方法制备一
系列含不同比例
DSPE- PEG-iRGD
或
DSPE-PEG- RGD
的含药靶向脂质体
(iRGD
配体密度分别为
DSPE-PEG
的
1%
、
1.5%
和
2%, RGD
配体密度分别为
DSPE-PEG
的
25%
和
50%)
。取
B16
细 胞接种于
6
孔板中
,
待细
胞长满后弃原培养基
,
加入无血清培养基稀释的不
同配体密度的含药脂质体
(
阿霉素终浓度
9
μ
mol·L
?
1
),
37
℃
孵育
1.5 h,
弃培养基
,
用预冷的
PBS
洗< /p>
3
次
,
胰酶消化离心
,
再用预冷的
PBS
洗
3
次并离心< /p>
,
流
式细胞仪测定细胞摄取的
DOX
荧光强度
(
激发波长
488 nm,
测定波长
560 nm)
。
细胞毒性实验
采用
S RB
的方法评价脂质体对
B16
黑色素瘤细胞系的细胞毒 性
[7]
。
将
B16
< p>细胞接种
于
96
孔板中
,
每孔
5 000
个
, 3
～
6
个复孔。
置于细胞
培养箱中培养
1
天
,
细胞贴壁后将一系列浓度的阿霉
素脂质体及游离阿霉素溶液
(
阿霉素终浓度分别为
0.03, 0.1, 0.3,
1, 3, 10
μ
mol·L
?
1< /p>
)
加入细胞培养孔
,
设
置溶剂对照和空白参比孔。给药细胞于细胞培养箱
中孵育
48 h
后吸取培养液
,
用
PBS
清洗
,
在培养孔
结果
1
导向化合物的合成
反应进程采用薄层色谱监测。随着反应的进行
,
iRGD
和
RGD
原料点逐渐变浅
,
最终在
48 h
消失
(
结果未显示
)
。
iRGD
相对分子质量为
978.06, RGD
相对分子质量为
346.35, DSPE-PEG- NHS
平均分子
质量约为
3 094
。
MOLDI-TOF MS
分析反应产物结
果如图
1
所示
,
可以看到产物
DSPE-PEG- iRGD
相对
分子质量在
4 000
左右
,
表明
iRGD
已成功连接到
DSPE-
PEG
末端
,
得到导向化合物
DSPE- PEG-iRGD;
产物
DSPE-PEG- RGD
相对分子质量在
3 400
左右
,
表明
RGD
已成功连接到
DSPE- PEG
末端
,
得到导向
化合物
DSPE-PEG- RGD
。
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