墨尔本 大学-墨尔本 大学
一
５８６一
重庆医科大学学报２０１０年第３５卷第４ 期
（
Ｊｏｕｒ
ｎａｌ
ｏｆ
Ｃｈｏｎｇｑｉ
ｎｇ Ｍｅｄｉ
ｃａｌ
Ｕｎｉ
ｖｅｒｓｉ
ｔ
ｙ ２０１０．ＶＯＩ
．
３ ５ Ｎｏ．
４）
技术与方法
文章编号：
０２
５３
—３
６２
６（
< p>２０１
０）
０
４
—０５
８
６—
０５
酮洛芬对映体的分
离、分析方法的研究及其应用
李小梅，周
凤，赵
华，< /p>
靳红卫
４０００１６）
（重庆医科大学 药学院药物分析教研室，
重庆
【摘
要】目的：
< p>考察酮洛芬（Ｋｅｔｏｐｒ
ｏｆ
ｅｎ，
ＫＴ） 对映体在多糖衍生物手性固定相的色谱行为，
建立酮洛芬对映体的分离分析方法，
并用于血浆样品中酮洛芬对映异构体的测定。方法：色谱柱Ｃｈｉ
ｒ< /p>
ａｌ
ｐａ
ｋＡＤ（２５０ｍｍｘ
４．
６ｍｍ，
１０ ｍ，
Ｄａｉ
ｃｅｌＣｈｅｍｉ
ｃ ａｌ
ｓ），流动相组
成为正己烷：
异丙醇：
< p>ＴＦＡ（８０：２０：
０．
０２），
检测波长 ２５４
ｎｍ，
流速１．
０
ｍ１
］
ｍｉ
ｎ，
柱温为２５℃。结果：酮洛芬对映体在１
０
ａ
ｒ
ｉ
ｎ内实现分
离，分离度大于２．
０，
对映体Ｒ和Ｓ分别在血药浓度０．
１～ １０ ｇ／
ｍｌ范围内线性关系良好Ｒ一（一）
（，
：
< p>＝０．
９９９
８），
ｓ一（ ＋）（
ｒ
－
＝
０．
９９９６），< /p>
单
一
对映体的最低检测限为２
ｎｇ（
Ｓ／
Ｎ＝３）。结论：
建立了用Ｃｈｉ
ｒ< /p>
ａｌ
ｐａｋＡＤ柱分离分析酮洛芬对映异构体的方法，可用于单一对映异
构体的光学纯度检测及药理学研究。
【关键词】
高效液相色谱法；
酮洛芬；
对映体；
手性分离
【中国图书分类法分类号】
Ｒ９１７
【文献标识码】
< p>Ａ【收稿日期】
２００９—１１－０２
Ｔｈｅ
ｓｅｐａｒ
ａｔｉ
ｏｎ ａｎｄ
ｄｅｔ
ｅｒ
ｍｉ
ｎａｔｉ
ｏｎ
ｏｆ
< p>ｋｅｔ
ｏｐｒ
ｏｆ
ｅｎ ｅｎａｎｔ
ｉ
ｏｍｅｒ
ｓ ｉ
ｎ ｐｌ
ａｓｍａ
ｂｙ
ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｃｏｌ
ｕｍｎ
ＬＩＸｉ
ａｏ—ｍｅｉ，ｅｔ
（Ｄｅｐａｒ
ｔ
ｍｅｎｔ
ｏ
ｆＰｈａ
ｒ
ｍａｃｅｕｔ
ｉ
ｃ ａｌ
Ａｎａｌ
ｙｓｉ
ｓ，Ｃｏｌ
ｌ
ｅｇｅ
ｏ
ｆ
Ｐｈａ
ｒ
ｍａｃｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉ
ｎｇＭｅｄｉ
ｃａｌ
Ｕｎｉ< /p>
ｖｅｒ
ｃｉ
ｔ
ｙ）
【Ａｂｓ
ｔ
ｒ
ａｃ
ｔ］
Ｏ ｂ
ｊｅｃｔ
ｉ
ｖｅ：
Ｔｈｅ ｓｅｐａｒ
ａｔ
ｉ
ｏｎ ｅ
ｆ
ｅｃｔ
ｆ
ｏ
ｒ
ｔ
ｈｅ ｅｎａｎｔ
ｉ< /p>
ｏ
ｍｅ
ｒ
ｓ
ｏｆ
ｋｅｔ
ｏｐｒ
ｏｆ
ｅｎ ｏｎ ｆ
ｏｕｒ
ｄｉ
ｆ
ｅ
ｒ
ｅｎｔ
ｃｈ ｉ
ｒ
ａ
ｌ
ｃｏｌ
ｕｍｎｓ
ｗａｓ
ｉ
ｎｖｅ
ｓｔ
ｉ
ｇａｔ
ｅｄ ａ
ｎｄ
ｅｓｔ
ａｂｌｉ
ｓｈｅｄ ａ ｓｅｎｓｉ
ｔ
ｉ
ｖｅ ａｎｄ ｓ ｔ
ｅｒｅｏｓｐｅｅｉ
ｉ
ｆ
ｃ ＨＰＬＣ ｓｅｐ ａｒａｔ
ｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔ
ｅｒｍｉ
ｎａｔ
ｉ
ｏｎ ｍｅｔ
ｈｏｄ ｆ
ｏ
ｒ ｋｅｔ
ｏｐｒ
ｏｆ
ｅｎ ｅｎａｎｔｉ
ｏｍｅｒｓ ｉｎ ａｎｉ
ｍａｌ
ｐｌ
ａｓｍａ．
Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ：
Ｔｈｅ
ｅｎａ
ｎｔ
ｉ
ｏｍｅｒ
ｓ
ｏ
ｆ
ｋｅｔ
ｏｐｒ
ｏｆ
ｅｎ
ｗａｓ
ｒ
ｅｓ
ｏｌ
ｖｅｄ
ｉ
ｎ
ｈ
ｅ
ｔ
ｎｏｒ
ｍａ
ｌ
ｐｈａ
ｓ
ｅ
ｍｏｄｅ
ｂｙ
ｕｓ
ｉ
ｎｇ
< p>ｎ—ｈｅｘａｎｅ：
ｉ
ｓ
ｏｐｒ
０
ｐａｎ０ｌ
：
ＴＦＡ（８０：
２０：
０．
０２）ａｓ
ｍｏｂｉ
ｌｅ ｐｈａｓｅ
ｗｉ
ｈ
ＵＶ ｄｅｔ
ｔ
< p>ｅｃｔｏｒ
ａｔ
ａ
ｗａ ｖｅｌｅｎｇｔｈ
ｏｆ
２５４
ｎｍ．
Ｔｈｅ
ｌ
ｆ
ｏｗ
ｒａｔ
ｅ
ｗａｓ １．
０ ｍｌ
／ｍｉ
ｎ．Ｒｅｓｕｌｔ
< p>ｓ：Ｌｉｎｅａｒ
ｃａｌｉ
ｂｒａｔ
ｉ
ｏｎ ｃｕｒｖｅｓ
ｗｅｒｅ
ｏｂｔ
ａ
< p>ｉｎｅｄ
ｉ
ｎ
ｈ
ｔ
ｅ
ｒ
ａｎｇｅ
０．
１－１０ ｇ
／
ｍｌｆ
ｏ
ｒ
Ｒ一（＋）
一ｋｅｔ
ｏｐｒ
ｏｆ
ｅｎ（ｒ
＝Ｏ．
９９９
８）ａｎｄ
Ｓ一（＋）
一ｋｅｔ
ｏｐｒ
ｏｆ
ｅｎ（ｒ
＝Ｏ．
９９９
６）ｉ
ｎ
ｐｌ
ａｓ
ｍ ａ．
Ｔｈｅ
ｄｅｔ
ｅｃｔ
ｉ
ｏｎ
ｌ
ｉ
ｍｉ
ｔ（Ｓ／
Ｎ＝３）
Ｗａ
ｓ
２
ｎｇ
ｏ
ｆ
ｒ
ｅ
ａｃｈ
ｅ
ｎａｎｔ
ｉ
ｏｍｅｒ
．Ｃｏｎｃｌ
ｕｓｉ
ｏｎ：
Ｔｈｉ
ｓ
ｍｅ
ｔ
ｈｏｄ
ｉ
< p>ｓ
ｓ
ｉ
ｍｐｌ
ｅ，
ｆ
ａｓ
ｔ
ａｎｄ
ｃ
ａｎ
ｂｅ
ｕｓ
ｅｄ
ｔ
< p>ｏｄｅｔ
ｅｃｔ
ｏｐｔ
ｉ
ｃａｌ
ｐｕｒ
ｉ
ｔ
ｙ
ｏｆ
Ｓ－（＋）
一ｋｅ
ｔ
ｏｐｒ
ｏ
ｆ
ｅｎ
ａ
ｎｄ
ｍｏｎｉ
ｔｏｒ
ｐｈａｒｍａｃｏｋｉ
ｎｅｔｉ
ｃ ｓｔｕｄｉｅｓ
ｏｆ
ｋｅｔ
< p>ｏｐｒｏｆｅｎ
ｅｎａｎｔ
ｉ
ｏｍｅｒｓ．
【Ｋｅ
ｙ
ｗｏｒ
ｄｓ 】ＨＰＬＣ；
Ｋｅｔ
ｏｐｒ
ｏｆ
ｅｎ；
< p>Ｅｎａｎｔｉ
ｏｍｅ
ｒ
ｓ；
Ｃ ｈｉ
ｒ
ａｌ
ｓｅ
ｐａ
< p>ｒａｔ
ｉ
ｏ
ｎ
酮洛
芬（Ｋｅ
ｔ
ｏ
ｐｒ
ｏｆ
ｅｎ，
ＫＴ）是２一芳基丙酸类非甾体抗炎药
（Ｎｏｎ—ｓ
ｔ
ｅｒ
ｏｉ
ｄａｌ
ａｎｔ
ｉ
< p>—ｉｎｆ
ｌ
ａ
ｍｍａｔ
ｏｒ< /p>
ｙ ｄｒ
ｕｇ，
ＮＳＡＩ
Ｄｓ），该药物具有
一
点。本文考察了酮洛芬对映体在多糖手性色谱柱：
Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｅｅｌ
ＯＪ
柱，
Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｃｅｌ
ＯＤ柱，
Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｐａｋＡＤ柱和Ｃ ｈｉ
ｒ
ａｌ
ｐａｋＡＳ柱上的色
个手性
中心（如图１），药理学研究发现，
只有Ｓ一（＋）一ＫＴ才
谱行为，
并建立了用Ｃｈｉ
ｒ
ａ
ｌ
ｐａｋＡＤ柱分析血浆样 品中酮洛芬
对映体的浓度的方法，
获得了满意效果。为酮洛芬单一对映
体异构体的光学纯度检测与药理学研究提供了有效的分析
方
法。
具有抗炎抗风湿和镇痛作用ｌ
ｌ
＿
。现已有Ｓ一（＋）
一ＫＴ的产品上
市。因此建立快速、
简便、
灵敏度高的ＫＴ对映体分析方法将
< br>有助于生产过程中药品的质量控制。目前ＫＴ对映体的分析
方法大致有：柱前手
性衍生化法［
３
１
，
手性柱色谱法 ，
< p>手性流
动相添加剂法 ，毛细管电泳法ｌ
】
０
１
。柱前手性衍生化法步骤繁
琐，可能引起消旋化；手性流
动相添加剂法则分离效果不如
手性固定相，毛细管电泳法则稳定性相对较差。手性固定
相
０Ｈ
高效液相色谱法可直接分离手性药物，该方法有操作
简便、
分离效果好、不需衍生化、
不改变组分结构、便 于收集等特
作者介绍：
李小梅（１
９８
４一），
女，
硕士，
研究方向：药物分
析。
通讯作者：赵
华，女，副教授，Ｅ—ｍａｉ
ｌ：ｚｈａｏｈｕａ．
ｃｑ＠ｓｏｈｕ．
ｃｏｎ。
图１
Ｋｅｔ
ｏｐｒ
ｏｆｅｎ结构图
重庆医科大学学报２０１０年第３５卷第４期
（
Ｊｏｕｒ
ｎａｌ
ｏｆ
Ｃｈｏｎｇｑｉ
ｎｇ Ｍ ｅｄｉ
ｃａｌ
Ｕｎｉ
ｖｅｒ
ｓｉ
ｔ
ｙ
２０１０．Ｖｏ１
．
３５
Ｎｏ．
４）
一
５８７—
１
材料和方法
１．１
仪器与试剂
< br>１
３本岛津公司高效液相色谱仪ＬＣ一２０１０ＡＨＴ；
Ｃｌ
ａｓ
—
ｓ
ｉ
ｃ—ｖＰ色谱工作站。Ｔ ＧＬ一１６高速台式离心机（
上海安亭科学
仪器厂）；
ＸＷ一８０Ａ涡旋混合器（上海精科实业有限公司）；ＢＦ
２０００氮气吹干仪
（北京八方世纪科技有限公司），
ＢＳ２１
０Ｓ电
子分析天平（精度０．
０００ １
ｇ，
Ｓａｒ
ｔ
ｏｒ
ｉ
ｏ
ｕｓ公司）。
（±）
一酮洛芬和Ｓ一（＋）
一酮洛芬（＞９８％，
西南合成制药
厂提供），甲醇，无水乙醇、
正己烷、
< p>异丙醇（均为美国天地公
司，
色谱纯），正丙醇、异辛烷（天津市 光复精细化工研究所，
均为色谱纯），乙醚（上海马陆制药厂），
三氟乙酸（Ｔｒ
ｉ
ｌ
ｆ
ｕｏｒ
ｏａｃ
ｅｔ
ｉ
ｃ
ａｃｉ
ｄ，
ＴＦＡ）
等均为分析纯。
< p>
３
１
本大耳兔由重庆医科大学动物中心提供。
１
．
２
对照品溶液的制备
精密称取（４
－）
一酮洛芬１０＿
３
ｍｇ，
加甲醇溶解配得浓度为
１．
０３
ｍｇ／
ｍｌ的（４
－
）
< p>一酮洛芬储备溶液。取１００ １储备液至５
ｍｌ
容量瓶内，
用甲醇稀释至刻度，
摇匀，即得浓度 为２０．
６ ｔ
ｘｇ
／
ｍｌ
（４
－
）
一酮洛芬的对照品溶液。同上操作制 得ｌＯ．
６ Ｉ
ｘ
ｇ／
ｍｌ的Ｓ一
（＋）
～酮洛芬对照品溶液。
１＿
３
色谱条件
酮洛芬拆分色谱条件：
Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｐａｋＡＤ柱
（２５０ ｍｍ ｘ
４．
６
ｍｍ，１０ ｍ，
Ｄａｉ
ｃｅ ｌ
Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ
ｓ）、Ｃｈｉ
ｒ
< p>ａｌｃ
ｅｌ
ＯＪ柱
（２５０
ｍｍ
ｘ
４．
６
ｍｍ，１０ ｍ，<
/p>
Ｄａｉ
ｃｅｌ
Ｃｈｅｍｉ
ｃ
ａｌ
ｓ），氰基保护柱（４
ｍｎｌ
Ｘ
４
ｒ
ｎｍ，
１Ｏ
ｍ，江苏汉邦），
流动相：正己烷：
异丙醇：
ＴＦＡ、正己烷：< /p>
乙
醇：
ＴＦＡ、正己烷：
正丙醇：
ＴＦＡ、
正己烷：
异丙醇：
甲醇：
ＴＦＡ 、
正己
烷：
正丙醇：
甲醇：
< p>ＴＦＡ、正己烷：乙醇：
甲醇：
ＴＦＡ。流速
１．
０
ｍｌ
／
ｍｉ
ｎ，
柱温：
２５ ｃ
ｃ，检测波长２５４
ｎｍ。
血浆样品含量测定条件：
Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｐａｋ
ＡＤ柱
（
２５０
< p>ｍｍｘ
４．
６
ｍｍ，１０ <
/p>
ｘ
Ｉ
ｍ，Ｄａｉ
ｃ
ｅｌ
Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ
ｓ），
氰基保护柱（
４
ｍｍ
ｘ４
ｍｍ，１０
Ｉ
ｘｍ，
江苏汉邦），
流动相：
正己烷：
异丙醇：
ＴＦＡ（８０：
２０：
０．
０２） ；
流
速１．
０
ｍｌ
／
ｍｉ
ｎ；
检测波长：
２５４
ｎｒ
ｎ；
柱温：
２５ｃ
ｃ。
１．
４
血浆样品预处理
分别取试验兔子
血浆样品０．
４
ｍｌ于离心管中，加１
ｍｏｌ
／Ｌ
盐酸１
００
Ｘ
Ｉ
ｌ
，乙醚３
ｍｌ，
涡旋５
ｍｉ
ｎ，３
０００
ｄｍｉ
ｎ离心１ ５
ａ
ｒ
ｉ
ｎ，
分取有机层２ｍｌ，
Ｎ，挥干，
残渣加流动相２００Ｉ< /p>
Ｘ
ｌ溶解，
涡旋｝
昆
合３
０
ｓ后１５
０００
ｒ
／
ｍｉ
ｎ离心１０ｍｉ
ｎ，
取上清液２０
Ｌ
< p>Ｌｌ进样。
２
结
果
２．
１
手性固定相的选择
酮
洛芬分子中有２个苯环，
１个羰基，１个羧基，可能与
多糖衍生手性固
定相形成盯一订作用，偶极一偶极作用，氢
键等，根据３点作用原理＿
Ｉ
】
）
＇
多糖衍生物类手性固定相可能
适宜酮洛芬对映体的拆分。因此我们考察了酮洛芬对映体在
４种最常用
的多糖衍生物手性固定相色谱柱：
Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｐ ａ
ｋＡＤ
柱、
Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｐａｋＡＳ柱、
Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｃｅ
ｌ
ＯＤ柱和Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｃｅ ｌ
ＯＪ柱上的拆分
情况。结果发现酮洛芬对映体在Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｃｅ
ｌ
ＯＪ上的拆分效果最
< p>为理想，分离度达到了３．
１２，分离因子为１．
４０；Ｃｈｉ
ｒ
ａ
ｌ
ｐａｋＡＤ
柱最大分
离度为２．
２９，分离因子为１．
２７，色谱图见图２。在
本实验条件下，
Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｐａｋＡＳ柱和 Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｃｅｌ
ＯＤ对酮洛芬对映
体无法实现有效拆分。
２．
２
流动相的组成对分离度的影响
２．
２．
１
酸性调节剂对酮洛芬对映体拆分的影响
酮洛芬具
有羧基，<
/p>
显酸性，添加酸性添加剂可增加分离度和峰的对称
性，
在 Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｐａ
ｋＡＤ柱和Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｃｅｌ
ＯＪ柱上，固定流动相中正己
< br>烷：
醇的体积比为８０：
２０，
考察不同浓度三氟乙酸对酮 洛芬对
映体的分离度（Ｒｅｓ
ｏｌ
ｕｓ
ｉ
ｏｎ，Ｒ）的影响，
结果见图３。三氟乙酸
的加入对
酮洛芬对映体的分离有显著改善，三氟乙酸含量增
加至０．
０２％时分 离效果已趋于稳定，因此，作者选择添加三
氟乙酸的浓度为０．
０２％ 。
２．
２．
２醇类置换剂对分离的影响 多糖衍生物手性固定相
色谱柱的基础流动相通常是正己烷：
异丙醇、
正己烷：
乙醇，正
己烷：
正丙醇，
通常醇的含量增加，
流动相的极性增加，
洗脱
能力增强，药物的保留时间减小。为了得到酮洛芬对映体的
最佳分离效果我们考察了
异丙醇、乙醇、
正丙醇对酮洛芬对
映体分离的影响，
结 果发现：
在Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｐａｋＡＤ柱上使用乙醇 分
离效果最佳；在Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｃｅｌ
ＯＪ柱上则异丙醇分离效果较好，
具
体结果见表１。洗
脱顺序都是Ｒ先出峰，
Ｓ后出峰。在２种手
性固定相上，
几种不同的流动相环境中都未见反转现象。
流动相中少量甲醇的加入
对对映体的分离有一定的影
响。固定流动相中正己烷的浓度，
用不同比 列的甲醇分别代
替异丙醇、乙醇、正丙醇，
酮洛芬对映体的分离情况如 图４。
Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｐ ａ
ｋＡＤ柱上，
在正己烷：
异丙醇、
正己烷：
正丙醇体系中
随着甲醇的增加，
对映体的分离度增大；
而在正己烷：
乙醇体
系中随着乙醇被逐渐替换对映体的分离
度逐渐减小。在
Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｃｅｌ< /p>
ＯＪ柱上甲醇的加入使上述３种体系的拆分能力都
呈下降趋势。
２－
３
血浆样品的分析方法
< br>２Ｉ
３．
１
方法专属性
为避免血浆中内源 性杂质对酮洛芬对
映体分离的干扰，我们选择色谱柱：
Ｃｈｉ
ｒ
ａｌ
ｐａｋＡＤ柱（２５０
ｍｍ
４．
６ ｍｍ，１
０ ｍ，
Ｄａｉ
ｃｅｌ
Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ
ｓ）；流动相：
正己烷：
异
丙醇：
ＴＦＡ（８０：
２ ０：
０．
０２）；
流速１．
０
ｍ ｌ
／
ｍｉ
ｎ；柱温２５℃；检测波
长：
２５４
Ｒｉ
ｌ
ｌ作为血浆样品的分析条件。在此 条件下血浆中杂
质不干扰测定，酮洛芬对映体达基线分离，
适宜血浆样 品的
快速分析，
结果见图５。
２．
３．
２线性及最低检测限
取试验兔子空白血浆，分别加入
（±）
一酮洛芬对照品溶液适量，使其血浆药物浓度分别为
< p>ｏ．
２、
ｏ．
５、１、
２、
５、ｌ
０、２０ ｇ／
ｍｌ
。按“１－
４”
项下处理，
取上清液２Ｏ
ｌ进样，
分别 将Ｒ一（
一）
和ｓ一（
＋）酮洛芬峰面积（
Ｙ）< /p>
对酮洛芬
血浆浓度（ｘ）作直线回归得Ｒ一（一）
一酮洛 芬标准曲线方程：
Ｙ＝２１
７
０３５ Ｘ＋８
５９１．
５，
ｒ＝０．
９９９
８，
Ｓ－（＋）
一酮洛芬标准曲
线方程：
Ｙ＝２０９
５３５Ｘ一２
７７６．
６，
ｒ＝０．
９９９
６。
最低检测限：
取对照品溶液２０ Ｉ进样，当信噪比为３
时，
测得酮 洛芬对映体最低检测限均为２
ｎｇ。
２．
３ 回收率与精密度实验
取试验兔子空白血浆，
加入不
同浓度的（４－）
一酮洛芬对照品溶液，配制高、中、
低 （１、１
０、
２０
ｇ
／
ｍ１）
３种浓度的血浆样品各３份，
按“１．
４”项下处理，取２ ０
１进样，测得的Ｒ一（
一）、
ｓ一（＋）
< p>酮洛芬回收率，结果见表２。